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慢病毒包装操作方案

2023-05-24 来源:步旅网
慢病毒包装操作流程

一、材料

1 细胞培养试剂 试剂名称

DMEM/High glucose基础培养基 胎牛血清 丙酮酸钠 DMSO(冻存用)

2 慢病毒包装试剂 试剂名称

Lipofectamine 2000 Opti-MEM基础培养基 PEG6000溶液 NaCl溶液 HBSS溶液 3 耗材

终浓度 90% 10% 1mM 10% 试剂品牌 Invitrogen Invitrogen/Gibco Invitrogen

浓度 50% 40 mM 试剂品牌 Invitrogen Invitrogen Wako Invitrogen 50 mL离心管 15 mL离心管 10 cm细胞培养皿 μm过滤器 2 mL EP管

二、操作流程

1 细胞培养

1.1 293T/293FT细胞的复苏

1) 将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。在超净台内,用吸管吸取6~7mL

完全培养液至15 mL离心管中;

2) 快速将冻存的细胞从液氮中取出,并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动(水不

要没到盖子),使其在1~2分钟内完全融化;

3) 在超净台内,用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒,用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的

完全培养液中,轻轻吹打混匀,使冻存液分散开(目的是让DMSO分散,降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用)。

4) 在室温条件下,250 g离心4分钟。

5) 离心后,在超净台内小心倒去上清,用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液,

再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中,写上细胞名称、日期,放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。(首次复苏细胞时,离心重悬后需取样计数,根据细胞数选择面积合适的培养容器。)

6) 复苏翌日,给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。 7)

1.2 293T/293FT细胞传代

1) 待细胞长至60%-70%融合度即可传代。将培养瓶里的所有培养液全部移去,用1×PBS洗涤细

胞两次(洗涤速度要快,避免细胞干涸时间过长),以去除残余的培养液和血清(血清含有胰酶的抑制因子);

2) 加入适当的胰酶溶液,能使其完全浸过细胞即可,室温孵育1-2分钟。在显微镜下观察,可看

到大部分细胞变圆不贴壁,拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离,此时应立即终止消化,若细胞仍然有大部分贴壁,可适当延长孵育时间;

3) 加入等体积完全培养液终止消化,并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。用吸管

转移细胞悬浮液到15 mL 离心管中,用吸管吸取2-3 mL的PBS将残余细胞冲洗下来,一并加到15mL离心管中,混匀吹打10次使细胞分散;

4) 在室温条件下,250g离心4分钟。离心后,倒去上清,用2 mL完全培养液重悬细胞,取样计

数;

5) 根据计数结果,按照 2×10~5×10/cm的细胞密度接种细胞;写上细胞名称、日期,放置

37°C、 5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

注1:T75培养瓶建议293FT细胞接种×10;293T 接种×10细胞量。

注2:293T细胞生长达70%-80%融合度即可传代;293FT细胞生长达到60%融合度即可传代,不可生长过密;

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1.3 293T/293FT细胞冻存

1) 待细胞长至 70%-80%融合度即可传代。消化过程可参照相关步骤。

2) 消化后,取样待计数。计数同时,将细胞于室温条件下,250g离心4分钟。

3) 离心后,倒去上清(上清需吸取干净),根据计数结果,按×10细胞量/mL的密度,用冻存液

进行重悬,并将悬液平均分至事先做好标示的冻存管中,旋紧盖子,按所使用的冻存仪器操作步骤进行冻存。

注:冻存管标示内容包括:细胞名称,细胞代次,以及冻存批号(批号标示:时间+人员代码+批次流水号)。

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2 慢病毒包装

2.1 慢病毒包装前的准备工作

1) 包装培养皿的处理

病毒包装前的细胞需要接种在有明胶包被的培养皿上。接种细胞前,吸取%明胶加至培养皿中,能完全覆盖表面即可,室温静置包被30分钟。30分钟后吸走明胶,使其晾干液体即可。 2) 准备293FT/293T细胞。

细胞的生长状态影响病毒的生产。应使用复苏后传代培养至少两代的细胞包装慢病毒,但不能使用超过10代的细胞。将细胞传到包被了明胶的直径10 cm培养皿中。

2.2 慢病毒包装过程(脂质体转染法)

1) 转染前一天,接种293T细胞到一个直径10 cm培养皿中,接种细胞数量应以转染当天的细胞

生长达到90%~95%融合为佳(一个直径10 cm培养皿,如在上午接种×10个细胞,下午接种×10个细胞为宜;加10 mL含丙酮酸钠的血清培养基);

2) 转染当天,观察细胞能否包装病毒。主要观察的指标是:细胞是否接种均匀,细胞的融合程度

是否达到 90%~95%。若细胞的状态合适,则从细胞中去除培养液,加入5 mL病毒包装用培养液,为了避免细胞脱壁,培养液应沿培养皿壁缓慢加入。

3) 注:包装培养基不能含有抗生素,而且在每次使用前,培养基应37°C、5% CO2培养箱中平衡

pH值。

4) 准备 DNA-Lipofectamine2000复合物,以一个直径10 cm培养皿的用量为示范:

5) A. 准备一支无菌的5 mL离心管加入 mL无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒和慢病毒表达质

粒,充分颠倒混匀;

6) 注: 表达质粒用量(μg) =质粒大小(kb)×;无血清Opti-MEM培养液需预热至37°C。

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7) B. 准备另外一支无菌的5 mL离心管里,加入 mL无血清Opti-MEM培养液和68μL的

Lipofectamine2000,轻轻颠倒混匀,室温孵育30分钟;

C. 30分钟后,把含有质粒DNA的无血清Opti-MEM培养液加入到含Lipofectamine2000的无血清Opti-MEM培养液,轻轻颠倒混匀,室温孵育 30 分钟;

D. 30分钟后,DNA- Lipofectamine2000 复合物形成;溶液有可能变混浊,但是不会影响转染效果。

8) 把 DNA- Lipofectamine2000 复合物一滴一滴地添加到293T细胞中,轻轻地前后摇晃培养皿

以混匀复合物。放置 37°C、5% CO2 饱和湿度培养箱中培养。转染后的 4-6 小时内每隔 30 分钟需观察细胞毒性反应,当出现可观察的毒性反应时,应立即吸除原培养液,加入8 mL病毒包装用培养液,放置 37°C、5% CO2 饱和湿度培养箱中继续培养。

2.3 慢病毒收集和浓缩(PEG浓缩法)

1) 转染后48小时,收集含有病毒的培养液。把培养液吸到一支无菌的有盖 50 mL 离心管中,再

补加8 mL 病毒包装用培养液至还能产毒的细胞中;

2) 4°C、3000 rpm离心15分钟,低速离心病毒上清,去除细胞碎片,回收上清;

3) 转染后 72 小时,收集含有病毒的培养液。4°C、3000 rpm离心15分钟,低速离心病毒上清,

去除细胞碎片,回收上清。将48小时收集的病毒上清液和72小时收集的病毒上清液,用μm的小滤器过滤,用50 mL离心管收集滤液;

4) 根据滤液体积加入对应量的50% PEG6000和40 mM NaCl溶液。充分均匀混合液,静置于4°C

沉淀过夜(X mL病毒滤液加入 mL的50% PEG6000和 mL的40 mM NaCl)。

5) 次日取出浓缩管,4°C、1500g离心30分钟后倒掉上清,再进行4°C、1500g缓慢加速,减

速离心4分钟;

6) 用移液枪吸除多余上清,按照100 μL HBSS溶解一个10cm皿产毒量的比例,用适当的HBSS

体积,使用合适的枪头缓慢而充分地吹打沉淀至单个病毒悬液;

7) 按照每管100 μL病毒液分装到 mL冻存管中(分装前,应将标有病毒名称、批号的标签贴在

冻存管外壁),放置-80°C保存;填写病毒入库记录。

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