(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112114129 A(43)申请公布日 2020.12.22
(21)申请号 202011027741.0(22)申请日 2020.09.25
(71)申请人 苏州大学
地址 215137 江苏省苏州市相城区济学路8
号(72)发明人 刘密 马琳 刁璐
(74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有
限公司 32103
代理人 孙周强 陶海锋(51)Int.Cl.
G01N 33/53(2006.01)G01N 33/68(2006.01)G01N 15/14(2006.01)
权利要求书1页 说明书14页 附图10页
(54)发明名称
肿瘤特异性T细胞的检测方法(57)摘要
本发明公开了肿瘤特异性T细胞的检测方法，收集肿瘤细胞或者肿瘤组织的全细胞组分后，采用游离全细胞组分或者将全细胞裂解物组分负载于纳米/微米粒子后与外周免疫细胞共孵育，在癌症特异性T细胞被激活后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子即可确定外周血等外周组织中癌症特异性T细胞的含量。本发明全细胞裂解物组分为水溶性成分和非水溶性成分，为游离状态或者负载于纳米粒子或微米粒子，负载方式为全细胞的水溶性成分和非水溶性成分分别或同时被包载于粒子内部，和/或分别或同时负载于粒子表面；检测方法为流式细胞术、酶联免疫斑点技术、酶联免疫吸附技术、胶体金免疫层析法、基因检测技术等。
CN 112114129 ACN 112114129 A
权 利 要 求 书
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1.肿瘤特异性T细胞的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子，实现肿瘤特异性T细胞的检测；所述激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分。
2.肿瘤特异性T细胞含量的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子；再根据肿瘤特异性T细胞的数量与外周免疫细胞的数量比例得到肿瘤特异性T细胞的含量；所述激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分。
3.根据权利要求1或者2所述的检测方法，其特征在于，所述裂解物组分为水溶性裂解物组分和/或非水溶性裂解物组分。
4.根据权利要求1或者2所述的检测方法，其特征在于，所述裂解物组分为游离裂解物组分或者负载于微纳粒子上的裂解物组分。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述裂解物组分被负载于微纳粒子内部和/或表面。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述微纳粒子制备材料为有机材料、无机材料或生物材料；所述微纳粒子为微米粒子或者纳米粒子。
7.根据权利要求1或者2所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的条件为细胞可以生存的条件。
8.根据权利要求1或者2所述的检测方法，其特征在于，所述肿瘤为包括血液肿瘤和实体瘤，比如内分泌系统肿瘤、神经系统肿瘤、生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、血癌、皮肤癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、直肠癌、头颈癌、肾癌、骨癌、鼻癌、膀胱癌、甲状腺癌、食道癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、盆腔癌、睾丸癌、阴茎癌、淋巴癌、舌癌、牙龈癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤；所述特异性分子为蛋白质、多肽、核酸、糖或者脂类。
9.激活物在检测外周免疫细胞中肿瘤特异性T细胞中的应用；所述激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述裂解物组分为游离裂解物组分或者负载于微纳粒子上的裂解物组分。
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说 明 书
肿瘤特异性T细胞的检测方法
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技术领域
[0001]本发明属于免疫治疗和免疫检测领域，具体涉及一种基于全细胞的肿瘤特异性T细胞的检测方法。
背景技术
[0002]近些年来免疫技术的发展极其迅速，尤其是癌症的免疫治疗领域。随着对癌症认识的不断提高，人们发现人体的免疫系统和各类免疫细胞在抑制癌症发生、发展的过程中扮演着关键角色。最近几年PD-1抗体和CAR-T等疗法相继获批进入临床，其临床效果良好，但是癌症疫苗和PD-1抗体等癌症免疫治疗只对一部分患者有效。如何能在用药前或用药时判断免疫治疗药物是否有效以及患者预后就显得非常关键。
[0003]现有技术公开了一种能有效用于肿瘤特异性T细胞含量检测的检测颗粒、其相应的制备方法、包括其的试剂盒以及利用其进行肿瘤特异性T细胞含量检测的检测方法，在基于待测样品中的被激活的肿瘤特异性T细胞所分泌的细胞分泌物、被激活的肿瘤特异性T细胞的增殖状态或被激活的肿瘤特异性T细胞的细胞表面标志物中的任意一种或多种而进行该肿瘤特异性T细胞的含量的检测中用于激活肿瘤特异性T细胞。免疫疗法依托免疫系统被癌症特异性/相关性抗原激活的T细胞杀灭肿瘤细胞，因而病人体内癌症特异性T细胞的含量与免疫疗法的疗效密切相关。但是目前缺乏有效的手段全面准确地检测患者外周血中的癌症特异性T细胞含量。
发明内容
[0004]本发明提供一种检测外周组织中肿瘤特异性T细胞及其含量的方法，可以为癌症患者预后提供参考信息；肿瘤特异性T细胞与肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分或者负载裂解物组分的微纳粒子共孵育后被激活并分泌或表达一些特异性分子，通过检测所分泌或表达的这些特异性分子即可测定肿瘤细胞特异性T细胞的含量，其中关键技术在于T细胞的激活。[0005]本发明采用如下技术方案：
肿瘤特异性T细胞的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子，实现肿瘤特异性T细胞的检测。[0006]肿瘤特异性T细胞含量的检测方法，包括以下步骤，将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子；再根据肿瘤特异性T细胞的数量与外周免疫细胞的数量比例得到肿瘤特异性T细胞的含量。[0007]本发明中，激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分，还可以包括免疫佐剂，其中肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分中的裂解物组分可以为水溶性裂解物组分，也可以为非水溶性裂解物组分，优选水溶性裂解物组分与非水溶性裂解物组分。[0008]本发明中，激活物可以为游离细胞或者游离裂解物组分，也可以为负载于微纳粒
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说 明 书
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子上的裂解物组分；优选游离裂解物组分或者负载于微纳粒子上的裂解物组分；裂解物被负载于微纳粒子内部和/或表面。裂解物组分负载于微纳粒子内部和/或表面的方式包括但不限于非共价键吸附、静电相互作用、疏水相互作用、氢键相互作用、共价键等。本发明可以同时使用负载水溶性组分的微纳粒子和负载非水溶性组分的微纳粒子，也可以使用同时负载有水溶性和非水溶性组分的微纳粒子，或者使用只负载水溶性组分的微纳粒子，或者使用只负载非水溶性组分的微纳粒子。[0009]本发明中，孵育的条件为细胞可以生存的条件，如4℃～60℃，优选37℃；孵育的时间为1～100小时，比如5～70小时，优选10～50小时。[0010]本发明中，微纳粒子可以为有机材料、无机材料或生物材料，比如合成高分子材料、天然高分子材料或者无机材料。微纳粒子为微米粒子或者纳米粒子，其中纳米粒子的粒径为1nm～1000nm，优选为30nm～800nm，进一步的优选为50nm～600nm；微米粒子的粒径为1μm～1000μm，优选为1μm～100μm，进一步优选为1μm～10μm，最优选为1μm～5μm。具体微纳粒子的制备方法为现有技术，比如溶剂挥发法、透析法、挤出法、热熔法；微纳粒子的形状没有限定，比如球形、椭球形、桶形、多角形、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形。[0011]本发明将细胞裂解物组分负载于微纳粒子的方法为溶剂挥发法，比如复乳法，也可采用其他可将细胞裂解物负载于微纳粒子的方法。具体的，激活物为负载于微纳粒子上的细胞裂解物组分时，制备方法为将水相溶液加入微纳粒子材料有机相溶液中，超声或搅拌或均质处理后将其加入第一乳化剂溶液，再经过超声或者搅拌或者均质处理，然后将其加入第二乳化剂溶液，搅拌后得到负载细胞裂解物组分的微纳粒子，作为激活物；举例包括以下步骤：
（1）将水相溶液加入高分子材料有机相溶液中，超声或搅拌或均质处理后将其加入第一乳化剂溶液，再经过超声或者搅拌或均质处理，然后将其加入第二乳化剂溶液，搅拌后离心处理并重悬沉淀物得到剩余物或者超滤处理后得到剩余物；
（2）将步骤（1）的剩余物冻干，再分散于分散液中；或者将步骤（1）的剩余物分散于分散液中，再加入水相溶液，混合后静置，得到作为激活物的微纳粒子。[0012]上述将其加入第二乳化剂溶液后，搅拌后离心或超滤处理，即可得到内部负载裂解物组分，或者裂解物组分/免疫佐剂的微纳粒子。进一步的，在上述内部负载裂解物组分或者裂解物组分/免疫佐剂的微纳粒子表面负载裂解物组分或者裂解物组分/免疫佐剂。[0013]上述水相溶液为裂解物组分溶液，或者裂解物组分/免疫佐剂溶液；超声为探头超声或者任何其他超声方式；搅拌为机械搅拌、磁力搅拌等，均质处理为高压均质处理或高剪切均质处理等。[0014]优选的，水相溶液为裂解物组分溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1 ng/mL，优选1 mg/mL～100 mg/mL；水相溶液为裂解物组分/免疫佐剂溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1 ng/mL，优选1 mg/mL～100 mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01 ng/mL，优选0.01 mg/mL～20 mg/mL。高分子材料有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；高分子材料的浓度为0.5 mg/mL～5000 mg/mL，优选为100 mg/mL。第一乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为10 mg/mL～50 mg/mL，优选20 mg/mL。第二乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为1 mg/mL～20 mg/mL，优选5 mg/mL。分散液为PBS缓冲液或生理盐水或纯水。
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优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50 rpm，搅拌时间大于1
分钟，比如搅拌速度为50 rpm～1500 rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，使用高剪切均质机时转速大于1000 rpm。超声或者搅拌或者均质处理进行纳米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。[0016]本发明中，水相溶液、高分子材料有机相溶液的体积比为1∶（1.1～5000），优选1∶（1.5～500）；高分子材料有机相溶液、第一乳化剂溶液的体积比为1∶（1.1～1000），优选1∶（1.5～500）；第一乳化剂溶液、第二乳化剂溶液的体积比为1∶（1.5～2000），优选1∶（2～500）；分散液、水相溶液的体积比为1:10000～10000:1，优选为1:100～100:1，最优选为1:30～30:1。
[0017]本发明中，癌细胞或肿瘤组织全细胞为游离状态。所述肿瘤为包括血液肿瘤和实体瘤，比如内分泌系统肿瘤、神经系统肿瘤、生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、血癌、皮肤癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、直肠癌、头颈癌、肾癌、骨癌、鼻癌、膀胱癌、甲状腺癌、食道癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、盆腔癌、睾丸癌、阴茎癌、淋巴癌、舌癌、牙龈癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤。
[0018]本发明用于溶解非水溶性裂解物组分的增溶液为尿素水溶液、盐酸胍水溶液、脱氧胆酸钠水溶液、SDS水溶液、甘油水溶液、碱性溶液、酸性溶液、蛋白质降解酶水溶液、白蛋白水溶液、卵磷脂水溶液、无机盐水溶液、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton）水溶液、二甲基亚砜（DMSO）、乙腈、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、丙醇、异丙醇、吐温、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷、胆碱；非水溶性裂解物组分可以溶于增溶液或者有机溶剂，所述有机溶剂为DMSO、甘油、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等。[0019]本发明中，激活物激活T细胞后，T细胞所分泌的特异性分子为蛋白质、多肽、核酸、糖或者脂类；特异性分子表达后可位于细胞膜、细胞质、细胞器或者细胞核，通过检测可定性或者定量肿瘤特异性T细胞，检测方法包括但不限于流式细胞术、酶联免疫斑点技术、酶联免疫负载技术、胶体金免疫层析法、基因检测技术、多细胞因子检测技术。[0020]本发明所述免疫佐剂为免疫增强剂或免疫抑制剂；免疫增强剂或免疫抑制剂添加方式包括：只装载于微纳粒子内，只负载于微纳粒子表面，同时装载于微纳粒子内以及负载于微纳粒子表面。免疫增强佐剂用于增强检测可分泌或表达IFN-γ、IL-12等促炎性细胞标志物的免疫细胞；免疫抑制佐剂用于增强检测可分泌或表达IL-10等抗炎性细胞标志物的免疫细胞。
[0021]作用与效果
本发明提供了一种采用游离全细胞组分或负载于粒子的全细胞裂解组分激活外周组织中癌症特异性T细胞，并采用常规检测技术检测被激活的癌症特异性T细胞的含量，可以为癌症免疫治疗疗效提供信息支持。现有技术采用多肽抗原去刺激激活癌症特异性T细胞时所激活和后续检测到的癌症肿瘤特异性T细胞不准确，会影响后续免疫治疗的方案设计以及治疗效果。本发明将癌症细胞或组织的全细胞组分的游离态或者全细胞组分负载于纳米/微米粒子中用于激活癌症特异性T细胞并检测被激活的癌症特异性T细胞的含量，所检测到的癌症特异性T细胞含量更广泛和准确。
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附图说明
[0022]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。[0023]图1为本发明激活物的制备过程示意图；
图2为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图3为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图4为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图5为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图6为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图7为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图8为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图9为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图10为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图11为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图12为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图13为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图14为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图15为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图16为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图17为载有水溶性和非水溶性细胞组分的微纳粒子的结构示意图；图18为实施例1黑色素瘤的实验结果；图19为实施例2乳腺癌的实验结果；图20为实施例3黑色素瘤的实验结果；图21为实施例4肺癌的实验结果。
[0024]下列实验结果中肿瘤生长抑制实验图中每个数据点为平均值±标准误差（mean±SEM）；其他实验数据点为平均值±标准偏差（mean±SD）；肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，其他实验中的显著性差异采用t检验分析。*表示该组与对照组相比P＜0.05，有显著性差异；**表示该组与对照组相比P＜0.01，有显著性差异；***表示该组与对照组相比P＜0.0001，有显著性差异。具体实施方式
[0025]本发明公开了一种检测外周组织中肿瘤特异性T细胞的含量以预测患者预后，有助于疾病的诊断与治疗。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0026]本发明公开了一种检测外周组织中肿瘤特异性T细胞及其含量的技术：将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子，实现肿瘤特异性T细胞的
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检测；将激活物与外周免疫细胞孵育，然后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子，再根据肿瘤特异性T细胞的数量与外周免疫细胞的数量比例得到肿瘤特异性T细胞的含量。[0027]本发明中，激活物包括肿瘤细胞、肿瘤组织全细胞、肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分，其中肿瘤细胞裂解物组分、肿瘤组织全细胞裂解物组分中的裂解物可以为水溶性裂解物组分，也可以为非水溶性裂解物组分，优选水溶性裂解物组分与非水溶性裂解物组分。[0028]本发明中，激活物可以为游离细胞或者游离裂解物组分，也可以为负载于微纳粒子上的裂解物组分；优选游离细胞裂解物组分或者负载于微纳粒子上的裂解物组分；裂解物组分被负载于微纳粒子内部和/或表面。裂解物组分负载于微纳粒子内部和/或表面的方式包括但不限于非共价键吸附、静电相互作用、疏水相互作用、氢键相互作用、共价键等。本发明可以同时使用负载水溶性组分的微纳粒子和负载非水溶性组分的微纳粒子，也可以使用同时负载水溶性和非水溶性组分的微纳粒子、只负载水溶性组分的微纳粒子、使用只负载非水溶性组分的微纳粒子。
[0029]本发明采用肿瘤组织全细胞或者肿瘤细胞进行检测时可分为三步：（1）收集肿瘤细胞或者肿瘤组织；（2）将肿瘤细胞或者肿瘤组织全细胞与外周组织含有T细胞等免疫细胞的样品共孵育大于10分钟，比如16小时；（3）采用流式细胞术、酶联免疫斑点法（ELISPOT）、酶联免疫负载法（ELISA）、多细胞因子检测法等方法检测标志T细胞被激活的特异性分子。所述特异性分子可被分泌到T细胞外，可表达于T细胞表面或者位于T细胞内部。所述特异性分子可为蛋白质，核酸，糖类或者脂类。
[0030]本发明采用负载癌细胞裂解物组分或者肿瘤组织裂解物组分的纳米/微米粒子进行检测时可分为四步：（1）收集肿瘤组织全细胞或者肿瘤细胞；（2）制备肿瘤细胞裂解物组分或者肿瘤组织全细胞裂解物组分，并可以进而负载于微纳粒子；（3）将负载裂解物组分的微纳粒子或者裂解物组分与外周组织含有T细胞等免疫细胞的样品共孵育大于10分钟，比如16小时；（4）采用流式细胞术、酶联免疫斑点法（ELISPOT）、酶联免疫负载法（ELISA）、多细胞因子检测法等方法检测标志T细胞被激活的特异性分子。所述特异性分子可被分泌到T细胞外，可表达于T细胞表面或者位于T细胞内部。所述特异性分子可为蛋白质，核酸，糖类或者脂类。
[0031]本发明在将肿瘤细胞或肿瘤组织全细胞裂解后首先获取水溶性裂解物，然后获取非水溶性裂解物并采用特定方法增溶非水溶性组分，可采用游离态裂解物直接应用检测或者将其负载于微纳粒子再应用于检测；优选的，在实际应用中，同时收集水溶性组分和非水溶性组分，并负载于微纳粒子，提高了检测准确性。
[0032]本发明在将肿瘤细胞或肿瘤组织全细胞可直接使用尿素或盐酸胍溶液直接裂解和增溶并获取同时溶于增溶液中的非水溶性组分和水溶性组分，尔后可采用游离态组分直接应用检测或者将其负载于微纳粒子再应用于检测；优选的，在实际应用中，将裂解物组分负载于微纳粒子，提高了检测准确性。[0033]本发明中，肿瘤细胞或者肿瘤组织全细胞在裂解前或（和）裂解后可经过灭活或（和）变性处理后再使用，也可在细胞裂解前或（和）裂解后不经过任何灭活或（和）变性处理直接使用。灭活或（和）变性处理方法可以为紫外照射、高温加热，在实际使用过程中也可以采用放射线辐照、高压、冷冻干燥和甲醛等灭活或变性处理方法。本领域技术人员可以理
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解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。[0034]进一步的，激活物包括免疫佐剂，为免疫抑制剂或免疫增强剂，可只包载于微纳粒子内，也可被包载于微纳粒子内并同时负载于微纳粒子表面，或者只负载于微纳粒子表面。[0035]本发明激活物的制备过程示意图如图1，所述负载全细胞的微纳粒子的结构示意图如图1～图17所示；在实际使用过程中可以为只使用其中的某一种特定结构的微纳粒子，或者是同时使用两种或两种以上的不同结构的微纳粒子。图2-图5中微纳粒子表面和内部均含有免疫佐剂；图6-图9中免疫佐剂只分布于微纳粒子的内部；图10-图13中微纳粒子只在外表面含有免疫佐剂；图14-图17微纳粒子内部和外表面均无免疫佐剂；图2、图6、图10和图14中微纳粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于微纳粒子内部时未形成明显的内核；图3、图7、图11和图15中微纳粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于微纳粒子内部时形成了一个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；图4、图8、图12和图16中微纳粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于微纳粒子内部时形成了多个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；图5、图9、图13和图17中微纳粒子所包载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于微纳粒子内部时位于所形成内核的外层。每幅图中，1表示细胞或组织组分中的水溶性成分，2表示细胞或组织组分中的非水溶性成分，3表示免疫佐剂，4表示微纳粒子，5表示微纳粒子中的内核部分；a表示微纳粒子内部包载和表面负载的均为细胞或组织组分中的水溶性成分，b表示微纳粒子内部包载和表面负载的均为细胞或组织组分中的非水溶性成分，c表示微纳粒子内部包载的为细胞或组织组分中的非水溶性成分而表面负载的均为细胞或组织组分中的水溶性成分，d表示微纳粒子内部包载的为细胞或组织组分中的水溶性成分而表面负载的均为细胞或组织组分中的非水溶性成分，e表示微纳粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而微纳粒子表面也同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，f表示微纳粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而微纳粒子表面只负载细胞或组织组分中的水溶性成分，g表示微纳粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而微纳粒子表面只负载细胞或组织组分中的非水溶性成分，h表示微纳粒子内部只包载的细胞或组织组分中的非水溶性成分，而微纳粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，i表示微纳粒子内部只包载的细胞或组织组分中的水溶性成分，而微纳粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分。[0036]在一些实施例中，可以先将细胞裂解物组分包载于微纳粒子内，同时包载免疫佐剂；然后，将细胞裂解物组分负载于微纳粒子表面，同时在微纳粒子表面负载有免疫佐剂。在实际应用中，可以直接采用增溶液（如8M尿素水溶液或6M盐酸胍水溶液）直接裂解肿瘤细胞或肿瘤组织全细胞后直接溶解细胞裂解物组分，尔后将其负载于微纳粒子。[0037]将细胞裂解物组分负载于微纳粒子的方法为溶剂挥发法，也可采用其他任何可将细胞裂解物组分负载于微纳粒子的方法。在一些实施方案中，制备纳米粒子采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的微纳粒子制备材料为高分子材料，比如有机高分子聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），其分子量为24KDa-38KDa，PLGA材料为生物可降解材料且已被FDA批准用作药物敷料，适合作为微纳粒子制备材料；所采用的免疫佐剂为 poly(I:C) 或CpG。
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说 明 书
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将水相溶液加入高分子材料有机相溶液中，超声或搅拌或均质处理后将其加入第
一乳化剂溶液，再经过超声或搅拌或均质处理后，然后将其加入第二乳化剂溶液，搅拌后离心后重悬沉淀物或超滤处理后得到作为激活物的微纳粒子。所得微纳粒子内部负载细胞裂解物，或者细胞裂解物/免疫佐剂。[0039]进一步的，在上述内部负载细胞裂解物，或者细胞裂解物/免疫佐剂的微纳粒子表面负载细胞裂解物，或者细胞裂解物/免疫佐剂。具体包括以下步骤：
（1）将水相溶液加入高分子材料有机相溶液中，超声或搅拌或均质处理将其加入第一乳化剂溶液，再经过超声或搅拌或均质处理，然后将其加入第二乳化剂溶液，搅拌后，进行超滤纯化处理或离心处理重悬沉淀物后得到剩余物；
（2）将步骤（1）的剩余物冻干再分散于分散液中或者将步骤（1）的剩余物分散于分散液中；再加入水相溶液，混合后静置，得到作为激活物的微纳粒子，其负载细胞裂解物组分。[0040]上述水相溶液为细胞裂解物溶液，或者细胞裂解物/免疫佐剂溶液；搅拌为机械搅拌、磁力搅拌等；均质处理为高压均质处理、高剪切均质处理。[0041]优选的，水相溶液为细胞裂解物溶液时，其中蛋白/多肽的浓度大于1 ng/mL，优选大于1 mg/mL；水相溶液为细胞裂解物/免疫佐剂溶液时，其中蛋白/多肽的浓度大于1 ng/mL，优选大于1 mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01 ng/mL，优选大于0.01 mg/mL。高分子材料有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、异丙醇、氯仿二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯，优选二氯甲烷，高分子材料的浓度为0.5 mg/mL～5000 mg/mL ，优选为100 mg/mL。第一乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为10 mg/mL～50 mg/mL，优选20 mg/mL。第二乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为 3mg/mL～9 mg/mL，优选5 mg/mL。分散液为PBS缓冲液或生理盐水或纯水。[0042]优选的，搅拌为机械搅拌、磁力搅拌时，搅拌速度大于50 rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为1000 rpm～12000rpm，搅拌时间为0.5h～5h；超声处理时，时间大于0.1秒，比如2 秒～60分钟；均质处理时高压均质机压力大于100 psi, 高剪切均质机速度大于1000 rpm。进行纳米化时，超声时间长短或搅拌速度或均质压力或剪切速度及时间能控制制备的纳米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。[0043]本发明中，水相溶液、高分子材料有机相溶液的体积比为1∶（1.1～5000），优选1:10；高分子材料有机相溶液、第一乳化剂溶液的体积比为1∶（1.1～1000），优选1:2.5；第一乳化剂溶液、第二乳化剂溶液的体积比为1∶（1.5～2000），优选1:10；分散液、水相溶液的体积比为1:10000～10000:1，优选为1:100～100:1，最优选为1:30～30:1；比如10:1。[0044]优选的，将步骤（1）的剩余物冻干为将步骤（1）的剩余物重悬于冻干保护剂水溶液中，再冻干；冻干保护剂优选海藻糖（Trehalose）或蔗糖，浓度为2～8wt%，优选3-6wt%。[0045]微纳粒子的粒径为纳米级或微米级，能保证粒子被抗原提呈细胞吞噬，提高吞噬效率；纳米粒子的粒径大小为1nm-1000nm，更优选地，粒径大小为30nm-1000nm，最优选地，粒径大小为50nm-600nm；微米粒子的粒径大小为1μm-1000μm，更优选地，粒径大小为1μm-100μm，更优选地，粒径大小为1μm-10μm，最优选地，粒径大小为1μm-5μm。[0046]本发明中，采用尿素或者盐酸胍水溶液作为裂解溶液，在实际使用中亦可使用任何其他物质水溶液作为裂解溶液，如脱氧胆酸钠、SDS、pH大于7的碱性溶液、pH小于7的酸性溶液、白蛋白、卵磷脂、高浓度无机盐、Triton、吐温、DMSO、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、异丙醇、丙
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醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷、胆碱。[0047]在本发明中，纳米粒子的制备采用复乳法，在实际中也可采用任何其他常用的微纳粒子制备方法；微纳粒子的制备材料为PLGA，在实际中亦可采用任何其他可以制备微纳粒子的材料；在本发明部分实施例中采用为纳米粒子，部分实施例采用的是微米粒子，本领域技术人员在实际中可以根据实际情况选择采用微纳粒子；本发明部分实施例中采用的检测方法为流式细胞术，部分实施例采用的检测方法为酶联免疫斑点法（ELISPOT）或酶联免疫吸附法（ELISA），在实际中可以根据实际情况也可采用多细胞因子检测法等其他方法进行检测；本发明部分实施例中肿瘤特异性T细胞的特异性分子为干扰素-γ（IFN-γ），在实际应用中采用其他任何特异性分子，也可以是分泌型的，也可以是膜结合型的，为蛋白质、核酸、糖类、脂类；本实施例检测的特异性细胞因子为促炎型的，在实际应用中也可以采用抗炎型的，如IL-10， TGF-β。[0048]在本发明中，采用poly(I:C) 和CpG为免疫佐剂，在实际中亦可不加入免疫佐剂或者加入任何其他具有免疫增强/抑制功能的免疫佐剂，如模式识别受体激动剂、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、卡介苗（BCG）、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、内毒素、脂质体佐剂、GM-CSF、MF59、双链RNA、双链DNA、氢氧化铝、CAF01、人参、黄芪等中药有效成分。关于免疫佐剂，在本发明中可以添加也可以不添加，在添加免疫佐剂时免疫佐剂为微生物来源的免疫佐剂、人或动物免疫系统的产物、固有免疫激动剂、适应性免疫激动剂、化学合成药物、真菌多糖类、中药类中的至少一类。
[0049]为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0050]如无特殊说明，本发明实施例中所使用的具体方法均为常规方法；所使用的材料、试剂等均可从商业途径得到。本发明实施例中所涉及到的微纳粒子结构、制备方法、与外周组织中T细胞共孵育方法、检测被激活T细胞时使用策略等仅为代表性方法，其他微纳粒子结构、制备方法、与外周组织中T细胞共孵育方法、检测被激活T细胞检测时使用策略亦可采用本发明所述的方法。实施例中仅列出了本发明在部分癌症中的应用，但是本发明亦可用在其他癌症。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
[0051]实施例1 黑色素瘤荷瘤小鼠外周组织中癌症特异性T细胞的检测
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明采用游离的癌细胞全细胞裂解物检测外周组织中的肿瘤细胞特异性T细胞并检测肿瘤细胞特异性T细胞的含量。因为小鼠外周血较少而且外周血中的外周免疫细胞数量有限，而脾脏中血流丰富含有足够的外周免疫细胞，所以本实施例采用小鼠脾脏中的外周免疫细胞进行相关检测，脾脏中的免疫细胞属于外周
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免疫细胞，外周血中的免疫细胞也属于外周免疫细胞。在临床实际应用中，可以采用人体外周血中的外周免疫细胞进行检测。[0052]本实施例中，以B16-F10小鼠黑色素瘤细胞为肿瘤细胞模型。首先裂解B16-F10细胞以制备B16-F10细胞的裂解物组分；然后，将游离的肿瘤细胞裂解物组分与外周免疫细胞共孵育过夜；最后采用流式细胞术分析肿瘤特异性T细胞的特异性分子γ干扰素。具体如下：
（1）肿瘤细胞的裂解及各组分的收集收集B16-F10细胞，去除培养基后采用-80℃冷冻，加超纯水后反复冻融3次，并同时辅以150W超声处理以破坏裂解细胞；待细胞裂解后，将裂解物以12000 RPM的转速离心5分钟并取上清液即为B16-F10中水溶性裂解物组分；在所得沉淀部分加入8M尿素水溶液溶解即为B16-F10中非水溶性裂解物组分。[0053]（2）游离肿瘤细胞裂解物组分与外周免疫细胞共孵育
选取6-8周的雌性C57BL/6制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种150000个B16-F10细胞。在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别皮下注射现有负载癌细胞全细胞组分的纳米癌症疫苗或PBS。在实验中，从第6天开始每三天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52*a*b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。分别在第18天、24天时，将PBS组和采用疫苗治疗组的C57BL/6小鼠处死，收集其脾脏中的外周免疫细胞，分别进行平行实验。[0054]将细胞重悬于含有10% FBS的DMEM培养基中，其浓度为4×106个细胞/mL；然后在其中加入10%体积（以培养基为基数）的水溶性裂解物组分（40mg/mL）和1%体积（以培养基为基数）的非水溶性裂解物组分(30 mg/mL)；在37ºC含5%CO2条件下孵育20小时；然后400g离心后收集孵育后的小鼠脾细胞。[0055]（3）采用流式细胞术检测被激活的癌症特异性T细胞
先采用Fc block 处理上述收集的小鼠脾脏细胞以避免非特异性负载。然后采用CD3抗体，CD4抗体，CD8抗体对小鼠脾细胞进行细胞外染色和，在固定细胞和对细胞进行破膜后采用FN-γ抗体对小鼠脾脏细胞进行细胞内染色。尔后采用FACS AriaTMIII系统检测小鼠脾细胞并采用FlowJo 10软件对结果进行分析。分别分析CD4+ T细胞中被激活后可以分泌IFN-γ的T细胞在所有CD4+T细胞中所占的比例和CD8+ T细胞中被激活后可以分泌IFN-γ的T细胞在所有CD8+T细胞中所占的比例。[0056]（4）实验结果
图18为上述实验结果，其中a为癌症疫苗治疗对肿瘤生长速度的抑制效果实验 （n≥8），b为流式细胞术分析外周脾脏外周免疫细胞中与肿瘤组织裂解物孵育后被激活的癌症特异性CD8+T细胞占脾脏中CD8+细胞的比率，c为流式细胞术分析外周脾脏外周免疫细胞与肿瘤组织裂解物孵育后被激活的癌症特异性CD4+T细胞占脾脏外周免疫细胞中CD4+细胞的比率。如图18所示，与PBS空白对照组相比，疫苗治疗组小鼠外周免疫细胞在与肿瘤细胞裂解物共孵育后被激活的T细胞明显较多，这说明经过癌症疫苗治疗的小鼠其外周组织中癌症特异性T细胞含量明显增多。由此可见，本发明所述的游离全细胞可用于检测癌症患者外周血中癌症特异性T细胞的含量。[0057]实施例2 乳腺癌荷瘤小鼠外周组织中癌症特异性T细胞的检测
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本实施例以小鼠乳腺癌为癌症模型来说明采用游离的肿瘤组织全细胞裂解物检测外周组织中的肿瘤细胞特异性T细胞并检测肿瘤细胞特异性T细胞的含量。因为小鼠外周血较少而且外周血中的外周免疫细胞数量有限，而脾脏中血流丰富含有足够的外周免疫细胞，所以本实施例采用小鼠脾脏外周免疫细胞进行相关检测。在临床实际应用中，可以采用人体外周血中的外周免疫细胞进行检测。[0058]本实施例中，以4T1小鼠乳腺肿瘤细胞为肿瘤细胞模型。首先裂解肿瘤组织全细胞以制备水溶性组分和非水溶性组分。然后，将游离的肿瘤全细胞裂解物组分与外周免疫细胞共孵育过夜。最后采用流式细胞术分析肿瘤特异性T细胞的特异性分子γ干扰素。[0059]（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只BALB/c小鼠背部皮下接种400000个4T1乳腺肿瘤细胞，在各只小鼠所接种肿瘤长到体积为200 mm3-1500 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入纯水并反复冻融5次。待肿瘤组织部位细胞裂解后，将细胞裂解物以3000 g 的转速离心20min取上清液即为肿瘤组织全细胞中水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即得非水溶性组分。[0060]（2）游离全细胞组分与外周免疫细胞共孵育
选取6-8周的雌性BALB/c制备乳腺肿瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种400000个B16-F10细胞。在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别皮下注射现有负载癌细胞全细胞组分的纳米癌症疫苗或PBS。在实验中，从第6天开始每三天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52*a*b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。在第24天，将采用疫苗处理组和PBS组小鼠处死，收集其脾脏中的免疫细胞。[0061]将细胞重悬于含有10% FBS的RPMI 1640培养基中，其浓度为4×106个细胞/mL；在其中加入5%体积（以培养基为基数）的水溶性组分 (35mg/mL) 和1%体积（以培养基为基数）的溶解于8M尿素的非水溶性组分 (35mg/mL)；在37ºC含5%CO2条件下孵育18小时；然后400g离心后收集孵育后的小鼠脾细胞。[0062]（3）采用流式细胞术检测被激活的癌症特异性T细胞
先采用Fc block 处理小鼠脾脏细胞以避免非特异性负载。然后采用CD3抗体，CD4抗体，CD8抗体对小鼠脾细胞进行细胞外染色和，在固定细胞和对细胞进行破膜后采用FN-γ抗体对小鼠脾脏细胞进行细胞内染色。尔后采用FACS AriaTMIII系统检测小鼠脾细胞并采用FlowJo 10软件对结果进行分析。分别分析CD4+ T细胞中被激活后可以分泌IFN-γ的T细胞在所有CD4+T细胞中所占的比例和CD8+ T细胞中被激活后可以分泌IFN-γ的T细胞在所有CD8+T细胞中所占的比例。[0063]（4）实验结果
图19为上述乳腺癌的实验结果。a为癌症疫苗治疗对肿瘤生长速度的抑制效果实验 （n≥9），b, 外周脾脏外周免疫细胞中与肿瘤组织裂解物孵育后被激活的癌症特异性CD8+T细胞占脾脏外周免疫细胞中CD8+细胞的比率； c, 外周脾脏外周免疫细胞中与肿瘤组织裂解物孵育后被激活的癌症特异性CD4+T细胞占脾脏外周免疫细胞中CD4+细胞的比率。[0064]如图19所示，与PBS空白对照组相比，疫苗治疗组小鼠外周免疫细胞在与肿瘤组织全细胞裂解物共孵育后被激活的T细胞明显较多。这说明经过癌症疫苗治疗的小鼠其外周组织中癌症特异性T细胞含量明显增多。由此可见，本发明所述的游离全细胞可用于检测癌
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症患者外周血中癌症特异性T细胞的含量。
[0065]实施例3黑色素瘤肿瘤组织裂解组分负载于纳米粒子激活外周组织中癌症特异性T细胞
本实施例以小鼠黑色素瘤模型来说明如何制备负载有黑色素瘤肿瘤组织全细胞组分的纳米粒子并采用该纳米粒子激活外周组织中的癌症特异性T细胞。T细胞被激活后采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测被激活癌症特异性T细胞的含量。
本实施例中，使用了酶联免疫吸附法（ELISA）来检测被激活T细胞分泌的IFN-γ，在实际应用中也可使用酶联免疫斑点法、流式细胞术等其他方法来检测被激活T细胞分泌的其他物质或者在细胞膜表面表达的其他物质。[0066]本实施例中，将小鼠B16-F10黑色素瘤细胞种植到C57BL/6小鼠，然后摘取肿瘤组织并将肿瘤组织裂解组分中的水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分同时负载于纳米粒子内部和表面。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织裂解物的水溶性组分和非水溶性组分的纳米粒子，并以此纳米粒子来激活小鼠外周组织中的癌症特异性T细胞。[0067]（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种150000个B16-F10黑色素瘤细胞，在各只小鼠所接种肿瘤长到体积为200 mm3-1500 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入纯水并反复冻融5次，每次融化时在150W超声处理2分钟。待肿瘤组织部位细胞裂解后，将瘤块组织的细胞裂解物以大于100 g的转速离心5min取上清液即为瘤块组织中可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的原非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述所得肿瘤组织裂解物的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分即为制备用纳米粒子的原料来源。[0068]（2）负载全细胞组分的纳米粒子的制备
本实施例中，负载细胞组分的纳米粒子和空白对照纳米粒子采用溶剂挥发法中的复乳法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，制备方法如前所述。此外，本实施例中也制备了同时负载四种黑色素瘤多肽抗原的纳米粒子，所使用的四种多肽抗原分别为Melan-A:26-35 (L27: GILTV), Melan-A: 51-73 (RR23: RNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR); gp100:25-33 (EGSRNQDWL) 和gp100: 44-59 (WNRQLYPEWTEAQRLD)。制备纳米粒子时每个多肽浓度分别为5 mg/mL。具体如下：
将200 μL上述水溶性组分溶液（30 mg/mL）和200μL非水溶性组分溶液（30 mg/mL）加入1 mL PLGA（100mg）二氯甲烷溶液中，常规超声处理30s，再与2.5 mL聚乙烯醇水溶液（20 mg/mL）混合，常规超声处理30s，再与50 mL聚乙烯醇水溶液（5 mg/mL）混合，常规搅拌至有机溶剂（二氯甲烷）挥发完成；然后12000rpm离心10 min，取出上清液后将沉淀重悬于20 mL海藻糖水溶液（4wt%）中，-80℃冷冻干燥后重悬于10 mL生理盐水中，再与0.5 mL上述水溶性组分溶液（30 mg/mL）、0.5 mL非水溶性组分溶液（30 mg/mL）混合，静置60s，得到纳米粒子内部和表面负载裂解组分的激活物。[0069]空纳米粒子、负载四种多肽抗原的纳米粒子制备同上，不加或者更换裂解组分即可。
[0070]在纳米粒子表面负载裂解物组分之前纳米粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子
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表面负载裂解物组分后所得纳米粒子粒径为300nm左右；每1 mg PLGA纳米粒子负载150μg裂解物组分。空白纳米粒子粒径为250nm左右。载多肽抗原纳米粒子粒径约为290nm左右，每1 mg PLGA纳米粒子多肽总负载量约为50μg多肽抗原。[0071]（3）纳米粒子激活癌症特异性T细胞
选取6-8周的雌性C57BL/6制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种150000个B16-F10黑色素瘤细胞。在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别皮下注射现有负载癌细胞全细胞组分的纳米癌症疫苗或PBS。在实验中，从第6天开始每三天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52*a*b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。分别在第18天、24天时，将PBS组、疫苗处理组的小鼠处死，收集其脾脏中的外周免疫细胞。
[0072]将细胞重悬于含有10% FBS的RPMI 1640培养基中，其浓度为5×106个细胞/mL。样品中加入终浓度为300μg/mL 的负载水溶性组分和非水溶性组分的纳米粒子；或者加入终浓度为300μg/mL的负载多肽抗原的纳米粒子；或者加入等量的空白纳米粒子；或者加入等量的游离全细胞裂解物组分；或者加入等量的游离多肽抗原。然后在37ºC（5%CO2）培养箱中培养72小时。尔后在400g离心5分钟，收集上清液，并采用ELISA法分析上清液中IFN-γ的浓度。
[0073]在ELISA检测方法中，肿瘤特异性T细胞被激活后会分泌特定的细胞分泌物如IFN-γ。该类特定细胞分泌物浓度的高低代表着被激活的癌症特异性T细胞的含量的多少。[0074]（4）实验结果
图20为上述黑色素瘤的实验结果。a, 癌症疫苗治疗对肿瘤生长速度的抑制效果实验 （n≥8），b, 采用ELISA法分析外周脾脏外周免疫细胞中与游离肿瘤组织裂解物或者负载肿瘤组织裂解物的纳米粒子孵育后被激活的癌症T细胞含量。[0075]如图20所示，与PBS空白对照组以及疫苗处理组中的空白纳米粒作用组相比，疫苗治疗组小鼠外周免疫细胞在与游离肿瘤组织全细胞组分，或者负载肿瘤组织全细胞组分的纳米粒子，或者游离多肽抗原，或者负载多肽抗原的纳米粒子共孵育后被激活的T细胞明显较多。这说明经过癌症疫苗治疗的小鼠其外周组织中癌症特异性T细胞含量明显增多。由此可见，本发明所述的游离肿瘤组织全细胞组分可用于检测癌症患者外周血中癌症特异性T细胞的含量。当使用游离肿瘤组织全细胞组分和游离多肽抗原去刺激激活T细胞时，游离全细胞组分可以刺激激活更多的T细胞；当使用负载全细胞裂解物组分的纳米粒子和负载多肽抗原的纳米粒子去刺激激活T细胞时，负载全细胞裂解物组分的纳米粒子可以刺激激活更多的T细胞；而且，负载全细胞裂解物组分的纳米粒子刺激激活的T细胞比游离全细胞裂解物组分刺激激活的T细胞更多。[0076]实施例4 肺癌肿瘤组织裂解组分和免疫佐剂负载于微米粒子激活外周组织中癌症特异性T细胞
本实施例以小鼠肺癌来说明制备负载有肺癌肿瘤组织裂解物组分和免疫佐剂的微米粒子以及只负载肺癌肿瘤组织裂解物组分的微米粒子激活外周组织中的肿瘤特异性T细胞，采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测肿瘤特异性T细胞的含量。本实施例分别测试了CpG或poly I:C 作为免疫佐剂、不添加免疫佐剂的效果。
本实施例使用了酶联免疫斑点法（ELISPOT）来检测被激活肿瘤特异性T细胞的特异性
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分子IFN-γ，在实际应用中也可使用流式细胞术、ELISA等其他方法来检测其他肿瘤特异性T细胞的特异性分子。[0077]本实施例中，将小鼠LLC肺肿瘤细胞种植到C57BL/6小鼠，然后摘取肿瘤组织并获得肿瘤组织裂解组分中的水溶性组分和溶于6M盐酸胍中的非水溶性后，以PLGA为微米粒骨架材料采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织裂解物的水溶性组分或者负载有非水溶性组分的微米粒子。肿瘤组织裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分别同时负载于微米粒子内部和表面；在含有免疫佐剂的微米粒子中，免疫佐剂只包载于微米粒子内部。并以此微米粒子检测小鼠外周组织中的肿瘤特异性T细胞。[0078]（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠侧背部皮下接种2000000个LLC肺肿瘤细胞，在各只小鼠所接种肿瘤长到体积为200 mm3-1500 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将相同大小的肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入纯水并对肿瘤组织全细胞进行常规的紫外照射和加热的灭活和变性处理，尔后反复冻融5次，每次融化时在250W超声1分钟。待肿瘤组织全细胞裂解后，将细胞裂解物以5000 rpm的转速离心15min，取上清液即为肿瘤组织全细胞中可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6M盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即得到非水溶性组分。
[0079]（2）负载全细胞组分的微米粒子的制备
本实施例中，负载细胞裂解物的微米粒子采用溶剂挥发法中的复乳法制备，所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，制备方法如前所述，具体可如下：
将150 μL上述水溶性组分溶液（60 mg/mL）或200 μL非水溶性组分溶液（10 mg/mL）加入2 mL PLGA （50mg）二氯甲烷溶液中，常规搅拌处理150s，再与10mL聚乙烯醇水溶液（15 mg/mL）混合，常规超声处理50s，再与300 mL聚乙烯醇水溶液（8 mg/mL）混合，常规搅拌至有机溶剂（二氯甲烷）挥发完成；然后10000 rpm离心30 min，取出上清液后将沉淀重悬于20mL蔗糖水溶液（5 wt%）中，-80℃冷冻干燥后重悬于5 mL生理盐水中，再与3 mL上述水溶性组分溶液（10mg/mL）、0.5 mL非水溶性组分溶液（40mg/mL）混合，静置20 min，得到纳米粒子内部和表面负载裂解组分的激活物。[0080]将150 μL上述水溶性组分溶液（60mg/mL）或200μL非水溶性组分溶液（10mg/mL）与100 μL免疫佐剂（CpG或poly I:C）溶液（0.25mg/mL）混合后加入2 mL PLGA (50mg) 二氯甲烷溶液中，常规搅拌处理150s，再与10 mL聚乙烯醇水溶液（15 mg/mL）混合，常规超声处理50s，再与300 mL聚乙烯醇水溶液（8 mg/mL）混合，常规搅拌至有机溶剂（二氯甲烷）挥发完成；然后10000 rpm离心30 min，取出上清液后将沉淀重悬于20 mL蔗糖水溶液（5wt%）中，-80℃冷冻干燥后重悬于5 mL生理盐水中，再与2mL上述水溶性组分溶液（10 mg/mL）、0.5 mL非水溶性组分溶液（40 mg/mL）混合，静置20 min，得到纳米粒子内部和表面负载裂解组分的激活物。
[0081]在微米粒子表面负载细胞裂解物组分前微米粒子平均粒径为2.0μm左右，微米粒子表面负载细胞裂解物组分后所得微米粒子粒径为2.1μm左右；每1 mg PLGA微米粒子负载160μg细胞裂解物组分。[0082]（3）微米粒子激活癌症特异性T细胞
选取6-8周的雌性C57BL/6制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮
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下接种2000000个LLC肺肿瘤细胞。在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别皮下注射负载现有癌细胞全细胞组分的纳米癌症疫苗或PBS。在实验中，从第6天开始每三天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52*a*b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。在第24天，将采用疫苗处理组和PBS组小鼠处死，收集其脾脏中的免疫细胞。
[0083]将细胞重悬于含有10% FBS的RPMI 1640培养基中，其浓度为5×106个细胞/mL。将100μL上述脾脏细胞加入预先包被有IFN-γ抗体a（capture antibody，包被抗体）并经过培养基封闭处理1小时以上的96孔板中。在其中加入25μg负载水溶性组分的微米粒子和25μg负载非水溶性组分的微米粒子，并在37ºC含5%CO2条件下孵育72小时。尔后，弃去细胞和微米粒子的混合物，洗涤96孔板并在加入IFN-γ抗体b（detection antibody，检测抗体）后在37ºC（5%CO2）培养箱中培养2小时以上。弃去含有IFN-γ抗体b的溶液，洗涤96孔板并采用相应的方法显色以在96孔板表面形成斑点。采用ELISPOT分析仪读取数据并分析实验结果。[0084]在ELISPOT检测方法中，肿瘤特异性T细胞被激活后分泌的细胞分泌物如IFN-γ会与96孔板包载的抗体a结合，在加入抗体b后，会形成双抗体夹心结构，而且检测抗体上连接有可以辅助显色的酶。当加入底物显色后，每一个被激活的细胞所在的位置都会形成一个斑点。一个斑点的形成就代表着一个被激活的肿瘤特异性T细胞，所以通过测量96孔板中每个孔中显色形成的斑点的数量，可以得知被检测样品中肿瘤特异性T细胞的数量。[0085]（4）实验结果
图21为上述肺癌的实验结果。a, 癌症疫苗治疗对肿瘤生长速度的抑制效果实验 （n≥9），b, 采用ELISPOT法分析外周脾脏外周免疫细胞中与负载肿瘤组织裂解物的微米粒子孵育后被激活的癌症T细胞含量。[0086]如图21所示，与PBS空白对照组相比，疫苗治疗组小鼠外周免疫细胞在与负载肿瘤全细胞组分的微米粒子或者负载肿瘤全细胞组分和免疫佐剂的微米粒子共孵育后被激活的T细胞明显较多。这说明经过癌症疫苗治疗的小鼠其外周组织中癌症特异性T细胞含量明显增多。而且，不论是CpG作为免疫佐剂还是Poly(I:C)作为免疫佐剂，在与外周免疫细胞共孵育后，负载肿瘤全细胞组分和免疫佐剂的微米粒子可以比负载肿瘤全细胞组分的微米粒子激活更多的T细胞。以上结果说明加入免疫佐剂能激活更多癌症抗原特异性T细胞。由此可见，本发明所述的游离全细胞可用于检测癌症患者外周血中癌症特异性T细胞的含量。[0087]癌症患者外周血等外周组织中的癌症特异性T细胞含量与患者预后呈正相关关系。本发明收集肿瘤细胞或者肿瘤组织的全细胞后，采用游离全细胞或者将细胞裂解物负载于纳米/微米粒子后与来自外周的外周免疫细胞共孵育，在癌症特异性T细胞被激活后检测肿瘤特异性T细胞的特异性分子即可确定外周血等外周组织中癌症特异性T细胞的含量。本发明的创造性在于将癌细胞、肿瘤组织全细胞、癌细胞裂解物组分或者肿瘤组织全细胞裂解物组分作为激活物检测外周免疫细胞中肿瘤特异性T细胞，涉及的粒子负载、细胞孵育、特异性分泌物检测等都为本领域现有技术。
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