实验方案
酵母菌酒精发酵的条件研究
学 院（部）： 生物与化学工程学院 专 业： 生物工程 学 生 姓 名： 鑫
学 号： 11018150
授课：XXX
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班 级： 生物工程二班
指 导 教 师： 肖
一、 实验目的
1、学会实验的设计和操作过程 2、找到酵母菌发酵时的最优条件 二、 培养基和实验方法及材料的确定 1、 玉米粉的糖化方法
玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下
玉米粉 → 加水 → 液化 → 糖化 → 发酵 → 蒸馏 → 成品酒精
试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。
液化：取１００ ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ ｇ／１００ ｇ玉米粉
糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ ｇ／１００ｇ玉米
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粉。
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2、 活化培养基
本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制 ，配方如下表一：
蔗糖 NaN03 K2HP04 KCl MgSO4·7HFeS04 2O 3g 0.3g 0.1g 0.050.05 g g 表一
3、 扩大培养基
0.001 g 琼脂 蒸馏水 pH 1.5-2100ml 7 g 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所以将其中的琼脂配料去掉。 4、 发酵培养基
糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5灭菌
三、 培养基的制备及酵母的活化
1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基
2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。
3、发酵液的制备
（1）玉米粉的筛选
实验前准备粉碎后的玉米粉700g。 （2）玉米粉的液化
按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。 器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g 步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。
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（3）玉米粉的糖化
将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。 （4）过滤
糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。 操作步骤：
最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。 （5）活化步骤
器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。
步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞。3、将灼烧后的接种针伸入母菌试管取粘取少量母菌，粘取前将接种针放于试管内壁，冷却5~6s。4、按照无菌操作将取过母钟的接种针移入活化试管内并画曲线。5在酒精灯火焰旁将试管棉塞塞上，塞前将棉塞烧一下。如此接种八支试管。并保存28℃培养2d。
四、 酵母的扩大培养
器材：液体培养基，活化后菌种，酒精灯，接种针，消毒酒精。 步骤：1、将器材放于试验台上，并对双手和桌面灭菌，接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁取下棉塞，并用接种针接种少量菌种于液体培养基内。3、在酒精灯旁塞好棉塞，并于28℃培养。根据发酵单因素的不同，确定培养时间。其中变量是菌龄的一瓶瓶号1、2要求培养时间分别为：对数期1：15~16h，对数期2:16~18h，缓冲期：20~24h，稳定期：24~26h。其他菌种培养20h进行接种。
五、发酵培养
1、 不同菌龄下的发酵
器材：扩大菌种的四个不同阶段即对数期1：15~16h，对数期2:16~18h，缓冲期：20~24h，稳定期：24~26h
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。移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。
步骤：1、将对数期1的菌种和其他设备放于实验台上。2、用移液管按照发酵液的10%的比例移取扩大培养液到发酵液中。3、塞好棉塞将发酵液放于30℃条件下培养2d。4、按照以上步骤将不同菌龄的扩大菌种移接到发酵液中进行发酵培养。之后进行酒精检测。
2、 不同菌量下的发酵
器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。 步骤：1、将实验器材放于实验台上。2、用移液管移取8%的扩大菌种到发酵液中。3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d。4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%的扩大菌种到发酵液中，30℃培养2d，之后进行酒精检测。
3、 不同醪液浓度下的发酵
器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。 步骤：1、将实验器材放于实验台上。2、用移液管移取10%的扩大菌种到4个发酵液中。3、制作不同浓度的醪液，分别按照1:2,1:3,,1:4，1:5。3、塞好棉塞，将四个发酵液三角瓶编号1、2、3、4。将发酵液按照序号存放于30℃条件下发酵2d。4、对发酵后的发酵液进行酒精检测。
4、 不同发酵时间下的发酵
器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。 步骤：1、将实验器材放于实验台上。2、用移液管移取10%的扩大菌种到4个发酵液中。3、塞好棉塞，将发酵液将四个发酵液三角瓶编号1、2、3、4。存放于30℃条件下发酵。按照序号分别培养2d、2.5d、3d、3.5d。4、对发酵后的发酵液进行酒精检测。
六、酒精检测
器材：蒸馏设备一套，200ml量筒4个，酒精检测器一个， 步骤：1、将100ml发酵液配制成200ml溶液于蒸馏烧瓶中。2、对200ml发酵液进行蒸馏，蒸馏出100ml酒精溶液。3、取一定量的蒸馏出的酒精溶液于试管中放于酒精检测器中进行酒精检测并记录数据，以上的四种发酵方法，均使用这种检测方法。数据记录于下表二
中：
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表二
注：发酵温度：T 发酵时间：D 接种量：S 菌龄：H
进行发酵培养是，除变量以外，其他条件按照，T=30℃、S=10%、H=20~24h、D=2d
七、最优条件的培养及最优条件确定
1、 以上四种最优条件共同作用下的发酵
器材：扩大培养液20~24h菌龄，发酵液，移液管，洗耳球
步骤：1、将实验器材放于实验台上。2、用移液管移取8%的扩大菌种到发酵液中。3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d。之后进行酒精检测，检测方法与六中相同。
2、 最优条件的确定、 八、实验进程及任务按拍
6/9：进入实验室进行仪器交接，同时取出母菌，进行活化前的预处理。
6/10：上午准备实验仪器和实验所用的药品进行灭菌处理和玉米粉的液化和糖化等，下午进行活化的接种。后进行
瓶号 S/% 产量 H 产量 料液比 产量 D/d 产量
1 8 对数期1 1:2 2
2 10 对数期2 1:3 2.5
3 12 缓冲期 1:4 3
4 14 稳定期 1:5 3.5
母菌的恒温培养2d。
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6/11：观察酵母菌的生长情况。
6/12：下午进行接种扩大培养，将母菌接种到用于菌龄不同的发酵培养液中。
6/13：上午进行发酵培养用于菌龄不同发酵的接种，按照时间安排进行接种。下午进行接种用于不同培养时间发酵的扩大培养的接种。 6/14
（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）
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