miRNA 靶基因3’UTR 质粒载体使用说明

RN：R10032.3

产品简介

miRNA是一类具有调控功能的非编码小RNA，主要通过与靶基因mRNA 3’UTR完全或不完全互补配对而调控靶基因的表达。pmiR-RB-Report™载体是专门用来检测miRNA作用的检测工具，将基因的3’UTR区克隆至载体海肾荧光素酶基因(hRluc)下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以萤火虫荧光素酶基因(hLuc)作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化情况来鉴定miRNA对该基因是否有调控作用。

载体图谱

hRluc：海肾荧光素酶基因，为报告基因； hLuc+：萤火虫荧光素酶基因，为内参基因； 3’UTR Region：多克隆位点，基因3’UTR连接位点； Ampr：氨苄青霉素抗性，用于大肠杆菌筛选。

pmiR-RB-Report™ Species-GeneName

~100 ng/μl

体积

每管含量

总含量

图1 pmiR-RB-ReportTM载体图谱简图

~50μl ~5μg ~10μg

注：质粒可以直接用来实验，甘油菌可以进行质粒扩大提取。

运输保存

产品一般以液体的形式常温运输。收到产品后，请将载体及甘油菌于-20℃以下保存。质粒可以直接用于实验，甘油菌可直接进行质粒扩大提取。

实验方法

质粒转化 扩增 转化菌株培养 菌种保存（15%甘油菌） 质粒提取 质粒 细胞转染

图2 pmiR-RB-ReportTM 质粒载体使用方法

荧光检测 细胞转染

为了降低由于细胞密度、转染效率、试剂用量等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议： a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；

b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。

1. 细胞类型与转染试剂：

由于实验需要同时转染小分子RNA和质粒载体两种物质，因此，细胞类型、细胞状态和转染试剂是决定实验成败的关键因素，建议选择转染效率较高的细胞系进行实验，如293T，Hela，A549，而转染效率较低的细胞系不适合进行本实验的检测。此外，转染试剂的选择也要考虑到两者共转的实验要求，建议采用适合共转的转染试剂如riboFECT™ CP。

2. 实验设置：

miRNA靶基因验证实验最重要的作用是确定miRNA结合位点，通常需要将野生型和突变型质粒载体与miRNA模拟物或抑制物共转，定量检测双荧光素酶的催化产生的荧光数值，鉴定miRNA作用靶点。具体实验设置请参考表1。

表1 miRNA靶基因验证实验设置参考

质粒载体 研究工具

1 3’UTR Reporter(WT) Mimic Ncontrol

2 3’UTR Reporter(WT)

miRNA mimic

3 3’UTR Reporter(Mut) Mimic Ncontrol

4 3’UTR Reporter(Mut)

miRNA mimic

注：（1）WT：野生型；Mut：突变型；

（2）常用miRNA mimic进行miRNA靶基因验证实验，如采用miRNA过表达质粒载体，miRNA过表达病毒载体，使用方法需要客户研究。

3. 转染浓度：

miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。锐博生物推荐的miRNA mimic转染浓度为50nM，miRNA inhibitor转染浓度为100nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围建议为10~200nM。

注：miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到预期的抑制效果，相当于miRNA mimic的几倍用量，这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。

4. 转染步骤：

以riboFECT™ CP Reagent共转miRNA mimic和靶基因3’UTR双荧光素酶报告载体质粒于96孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。 1）接种细胞

a. 贴壁细胞：转染前一天，接种1～2×104细胞至含有适量完全培养基的96孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到50~80%。

注：1）不同细胞生长速度和细胞大小不同，接种细胞的数量需依经验而定；2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布于培养基表面。

b. 悬浮细胞：

接种1×104~5×104个细胞至含有适量完全培养基的96孔板。

2）转染步骤

对于每个转染样品，请按以下步骤准备：

a. 稀释mimic：用7.5μl 1X riboFECT™ CP Buffer（v1）稀释0.25μl 20μM miRNA mimic储存液（v2）和1μl 100ng/μl

靶基因3’UTR双荧光素酶报告载体质粒（v3），轻轻混匀，室温孵育5min。

b. 混合液制备：加入0.75μl riboFECT™ CP Reagent（v4），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。

注：1）请不要振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；2）混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。

c. 将riboFECT™ CP混合液加入到90.50μl细胞培养基（v5）中，轻轻混匀。

注：混合液加入原细胞培养基，无需移除或更换。

d. （可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）。

。 e. 将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h（培养时间与实验目的相关）

表2 使用riboFECT™ CP转染miRNA mimic用量参考

v1: riboFECT™ CP Buffer (1X)； v2: 20μM miRNA mimic； v3: 3’UTR报告质粒； v4: riboFECT™ CP Reagent； v5: 细胞培养基

96-well *

100nM 50nM

100μl 100μl

7.5μl 7.5μl

0.5μl 0.25μl

1μl 1μl

0.75μl 0.75μl

90.25μl 90.50μl

30nM 100μl 7.5μl 0.15μl 1μl 20nM 100μl 7.5μl 0.1μl 1μl 10nM 100μl 7.5μl 0.05μl 1μl 24-well 100nM 500μl 30μl 2.5μl 5μl 50nM 500μl 30μl 1.25μl 5μl 30nM 500μl 30μl 0.75μl 5μl 20nM 500μl 30μl 0.5μl 5μl 10nM 500μl 30μl 0.25μl 5μl 12-well 100nM 1ml 60μl 5μl 10μl 50nM 1ml 60μl 2.5μl 10μl 30nM 1ml 60μl 1.5μl 10μl 20nM 1ml 60μl 1μl 10μl 10nM 1ml 60μl 0.5μl 10μl 6-well 100nM 2ml 150μl 12.5μl 25μl 50nM 2ml 150μl 6.25μl 25μl 30nM 2ml 150μl 3.75μl 25μl 20nM 2ml 150μl 2.5μl 25μl 10nM 2ml 150μl 1.25μl 25μl

注：1）*为实验参考用量，对于部分细胞类型需要进一步优化；2）转染质粒用力以100ng/μl浓度计算，可优化。

†

0.75μl 90.60μl 0.75μl 90.65μl 0.75μl 90.70μl 3μl 3μl

459.50μl 460.75μl

3μl 461.25μl 3μl 461.50μl 3μl 461.75μl 6μl

919.00μl

6μl 921.50μl 6μl 922.50μl 6μl 923.00μl 6μl 923.50μl 15μl

1797.50μl

15μl 1803.75μl 15μl 1806.25μl 15μl 1807.50μl 15μl 1808.75μl

5. Luciferase荧光测定：

1）设备与试剂：

a. 荧光照度计或多功能酶标仪；

b. Dual-Glo luciferase assay system（Promage）或其他兼容试剂。

2）检测步骤：

转染完成后24~48小时均可进行miRNA效果检测，最佳检测时间与使用的细胞类型有关，可通过分时检测来优化，具体使用步骤请参考Promega的说明书。

a. 将试剂盒的luciferase底物与luciferase buffer混合后分装，-80℃贮存，使用前平衡至室温，stop & Glo buffer分装后-80℃贮存，使用前平衡至室温并取适量加入stop & Glo底物，现配现用；

b. 取出待检测的培养板，吸去培养基，加入75μl/well新鲜培养基，并加入75μl/well配置好的 luciferase底物，涡旋振荡10min，以仪器如荧光照度计测定荧光值（hLuc荧光值）；

c. 加入配置好的75μl stop regent，振荡10min，以仪器如荧光照度计测定荧光值（hRluc荧光值）。

3）数据分析：

将各孔hRluc的荧光值与hLuc的荧光值比较，将比值与对照孔的比值进行统计分析。以表1的实验设置为例，结果如下图所示，统计过程中需以实验组1为参照，分析实验组2的变化，以判断miRNA对靶基因是否有影响。同时以实验组3为参照，分析实验组4的影响，以判断预测的结合位点突变是否会改变miRNA的作用。

图3 BCL2双荧光素酶检测实验结果示例

实验FAQ

1）客户特殊实验细胞系转染siRNA效果还可以，是否可以用来做这个实验？

答：不能确定，需要鉴定该细胞系是否适合RNA与3’UTR质粒共转，可通过riboMONITOR™来进行转染效率测定实验。

2）是否可以不设置突变组，而以空载作为对照？

答：如果需要确定miRNA结合位点，则必须设置突变组，空载对照不能说明问题。

3）实验结果中荧光值很低，内参荧光的荧光值只有几百，甚至几十，是什么原因？

答：可能质粒转染效果差或表达效果差，没有表达内参荧光。建议优化转染条件，或更换细胞系进行实验。另外也需检测仪器相关，不同的检测仪器的荧光值定量方式不完全一样，需要具体问题具体分析。