生物安全实验室自查报告

　　一、实验目的：

　　1、掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。2.了解细胞凋亡的生物学意义

　　3、掌握凋亡细胞的形态学检测方法

　　二、实验原理：

　　1、细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。

　　2、细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。

　　3、凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体;根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。

　　三、实验步骤：

　　细胞中过氧化物酶的显示

　　1、在载片上滴一滴PBS缓冲液；

　　2、取骨髓细胞：用断颈法处死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，剪开股骨一端，用牙签尖的一端插入剪开的小孔中，抠取少许骨髓细胞置滴有PBS的载片上；

　　3、涂片：用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开，室温晾干；

　　4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸铜液，以盖满涂片为宜，处理30秒-1分钟。5、倾去硫酸铜液，直接滴入联苯胺混合液反应6分钟（以盖满涂片为宜）6、清水冲洗，番红复染2min。

　　7、镜检：清水冲洗，室温晾干，先低倍镜下观察，后换高倍镜下观察（油镜100×）

　　细胞凋亡的形态学检测与观察吉姆萨染色:

　　1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞3、95%乙醇固定5min

　　4、PBS缓冲液洗2次

　　5、吉姆萨染色液染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液

　　7、普通光学显微镜下观察。吖啶橙染色:

　　1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞

　　3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min4、PBS缓冲液洗2次每次1min

　　5、0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液

　　6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。

　　四、结果与分析：

　　1、根据随机选择的几个视野的统计，该样品的细胞凋亡率=227/506×100=44.9

　　Hela细胞凋亡过程中核染色质的形态变化（吖啶橙染色）

　　五、思考题：

　　1、细胞凋亡的调控机制

　　细胞凋亡是一个受基因调控、众多细胞膜受体和胞浆蛋白参与的细胞主动自杀过程，其触发因素多种多样，包括细胞内诱导因子和抑制因子对细胞凋亡的调控。

　　2、细胞凋亡的特征

　　凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体。

　　3、研究细胞凋亡的方法

　　定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）

　　定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。