酵母菌等单细胞微生物生长曲线的测定

1 目的要求

（1）了解酵母菌、细菌等单细胞微生物生长曲线的特点及测定原理； （2）学习用血球计数板计数法和比浊法分别测定酵母和细菌的生长曲线。 2 基本原理

细菌群体的生长繁殖可分为四期：

1)．迟缓期（Lag phase）:细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少。迟缓期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。

2).对数期(Logarithmic phase):又称指数期(Exponential phage)。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。

3)．稳定期（Stationary phase）:该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽胞等。 4)．衰亡期（Decline phase）:随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。

体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。

生长曲线是单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。测定时一般将一定数量的微生物纯菌种接种到一定体积的已灭菌的适

宜的新鲜培养液中，在适温条件下培养，定时取样测定培养液中菌的数量，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，绘制得到生长曲线。不同的微生物其生长曲线不同，同一微生物在不同培养条件下其生长曲线亦不同。但单细胞微生物的生长曲线规律基本相同，生长曲线一般分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。测定一定培养条件下的微生物的生长曲线对科研和实际生产有一定的指导意义。

测定生长曲线时需要对生长的单细胞微生物定时取样计数，对于酵母细胞和比较大的细菌细胞可采用血球计数板计数法计数，亦可采用比浊法计数，但对于小的细菌细胞一般采用比浊法。

比浊法是根据培养液中菌细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比的关系，利用光电比色计测定菌悬液的光密度值（OD值），以OD值来代表培养液中的浊度即微生物量，然后以培养时间为横坐标，以菌悬液的OD值为纵坐标绘出生长曲线。此方法所需设备简单，操作简便、迅速。

血球计数板法是利用一块血球计数板来进行计数的。血球计数板（改良牛鲍计数板）用优质厚玻璃制成。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池画有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm.容积为0.1mm（ul），其中，中央大方格用双线分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域，用单线划分为16个小方格。四角的4个大方格是白细胞计数区域，用单线划分为16个中方格。根椐国际标准局（NBS）规定，大方格每边长度允许误差为±1%。

1)、取洁净的血球计数板，在计数室上面盖上盖玻片。

2)、取稀释到一定程度（5~10个酵母/小格）酵母液，从盖片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不能有气泡。先在低倍镜下找到小方格网后，再转换高倍镜观察并计数。

3)、如用16 X 25计数板，只计四个角上中方格的菌数。若是25 X 16的计数板，除计数四个角上的中格菌数外，还要计算中央中格的菌数。每个样品重复计数2~3次。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。 4)、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。 5)、计数方法：

样品中菌数/ml=每小格平均菌数×4000 ,000×稀释倍数，本实验采用25 x 16规格，要求数这些方格中的全部小格即80个小格。 设：每个中方格的菌数为A，则

每小格平均菌数=（A1+A2+A3+A4+A5)/80

样品中的菌数/ml= A1+A2+A3+A4+A5/80 ×4000,000×稀释倍数

单细胞微生物细胞数/mL=酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数 3 实验材料

3.1菌种 酵母菌和大肠杆菌。

3.2 培养基 豆芽汁液体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、5倍浓缩的牛肉膏蛋白胨培养液。 3.3 器材 722光电比色计或752紫外分光光度计、血球计数板、灭菌移液管或滴管。 4 实验方法与步骤

4．1 用血球计数板法测定酵母的生长曲线

（1）将酵母菌接种到豆芽汁培养液中，28℃振荡培养18h作为种子液备用。 （2）取装有 200mL灭菌豆芽汁培养液的500mL三角瓶2个。每瓶各接入种子液20mL，28℃振荡培养。

（3）于接种后的第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32、36、40、44、48h分别用无菌移液管从发酵三角瓶中取样1mL，用血球计数

板计数。

4．2 用比浊法测定细菌的生长曲线

（1）将大肠杆菌菌种接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，于37℃振荡培养18h备用。 （2）调节光电比色计的波长至420nm处，开机预热10～15min。

（3）以未接种的培养液校正比色计的零点（注意以后每次测定均需重新校正零点）。

（4）取装有200mL灭菌牛肉膏蛋白胨培养液的500mL三角瓶六个，分为两组，第一组三瓶中各接种20mL的大肠杆菌种子液，于37℃振荡培养，分别于0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24h取样，以未接种培养液调零，在光电比色计上比色。测定各样品的OD值。第二组三瓶区别第一组的是在接种培养6h后，无菌操作加入浓缩5倍的已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养液20mL，摇匀后继续培养。同样条件培养后同样时间间隔取样测定OD值。 5 实验结果

将实验结果填入下表 培养时间 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 正常生长 OD值 补料培养 OD值 （1）以培养时间为横坐标，菌数的对数值为纵坐标，绘出酵母菌的生长曲线图。 （2）以培养时间为横坐标，大肠杆菌菌悬液的OD值为纵坐标，绘出大肠杆菌在正常生长和补料培养两种条件下的生长曲线。 6 注意事项

用血球计数板计数时菌液太浓时需作适当稀释后计数，稀释倍数一般不超过100倍。 7 思考题

（1）比较酵母和细菌生长的曲线图。

（2）比较大肠杆菌在正常生长和补料培养两种条件下的生长曲线图有何不同？