响应面法对栗蘑多糖液体发酵培养基的优化

响应面法对栗蘑多糖液体发酵培养基的优化

作者：赵建英 贺莹

来源：《安徽农学通报》2016年第14期

摘 要：该文采用统计学方法对栗蘑虹灰1号菌株进行液体发酵配方优化，以得到适合栗蘑多糖发酵的最佳培养基配比。以栗蘑多糖含量为指标，首先采用前期单因素实验得出的6个因素，再进行Plackett-Bumrman设计筛选出影响栗蘑多糖含量的关键因素，通过响应面法确定关键因素的最佳用量和配比。结果表明：栗蘑菌株虹灰1号液体发酵培养基的最佳配方为：黄豆粉15g/L、玉米粉17.25g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾2.237g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5.88g/L，并在pH自然、25℃、140r/min条件下培养，比优化前产量提高了76.03%。 关键词：栗蘑；胞外多糖；发酵优化；响应面分析

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）14-0030-05

Abstract：The objective of the present study was the optimization of liquid fermentation medium for producing polysaccharide by Chestnut mushroom by the single factor tests and response surface methodology. Overall research was preceded by rational design. Technological condition parameters were determined according to regression analysis by Design-Expert 7.1.6. The RSM is feasible for optimum extraction process and this will improve the liquid fermentation medium for producing polysaccharide . The optimum condition was as follows：soybean powder 15g/L，corn flour 17.25g/L，glucose 20g/L ，KH2PO4 2.237g/L，MgSO4 2g/L and peptone 5.88g/L，pH7.0，25℃，140r/min，production increased by 76.03% than before optimization.

Key words：Chestnut mushroom；Extracellular polysaccharide；Fermentation optimization；Response surface analysis

栗蘑，又名灰树花、舞茸，是一种集食用和药用于一体的菇类，味道和口感俱佳，并且具有良好的药效，其中栗蘑多糖具有很好的抗癌作用[1]。栗蘑多糖是由葡聚糖及少量蛋白质的异聚糖复合物组成的，主要是以通过β-（1-6）糖苷键结合为主链的葡聚糖和以通过β-（1-3）糖苷键结合为主链的葡聚糖的混合活性葡聚糖。传统提取栗蘑多糖的方法是从野生栗蘑中获得，然而野生栗蘑数量有限，并且只有在达到一定树龄的老树根部才会生长，难以规模化生产[2-3]。而人工栽培栗蘑子实体同样存在生产周期长、产量有限的问题。通过现代的液体发酵培养技术可以在短时间内获到大量的栗蘑菌种的发酵产物，研究表明，液体发酵培养得到的栗蘑菌丝体与野生或人工栽培得到的栗蘑在化学成分或生理功能上均很相似，并且发酵液中含有较多的栗蘑多糖。近年来，栗蘑多糖液体发酵的研究取得了长足进展，但由于栗蘑菌株及培养基配方等原因，使培养产物有诸多差异。为此，本研究分别采用单因素试验、PB设计、中心组合试验以及响应面法，系统全面地对栗蘑多糖液体发酵培养的培养基配方进行了优化，以期筛选出最佳的培养基配方，从而对栗蘑多糖的发酵生产提供指导[4]。

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂 菌种：栗蘑试管菌种（购自唐山食用菌社）。试剂：土豆，黄豆，玉米粉（均购自同达森客超市）；葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸镁，硝酸铵，氯化铵，硫酸铵（均为分析纯），蛋白胨，酵母粉，实验室已具有。

1.2 仪器与设备 KDM型控温电热套（山东鄄城华鲁仪器公司），生化培养箱（上海跃进医疗器有限公司；型号 SPX-250），手提式蒸汽灭菌器（江阴滨江设备有限公司），电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），100g手提式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司），超净工作台（上海智诚；型号ZHJH-C1112B），恒温震荡培养器（上海智诚；型号ZWY-100D），电热鼓风干燥箱（上海博讯；型号GZX-9146MBE）。 1.3 方法

1.3.1 试验流程及操作要点 菌种的活化→种子液的制备→单因素试验→响应面法优化培养条件→验证试验。具体步骤为：先将菌种在PDA培养基上活化，并用摇床培养法制备种子液，条件为25℃、140r/min。种子液制备好后进行单因素试验，即选择不同碳源、氮源、无机盐对其进行摇床发酵培养，条件同上，测定栗蘑多糖含量，初步得出各因素对其的影响。再用响应面法对其营养条件进一步优化，通过验证性试验证明响应面方法优化得出栗蘑多糖的最佳发酵工艺条件是否具有良好的效果。

1.3.2 菌种的活化 将买回的菌种用已消毒的器具挖取1cm2大小，然后接种到PDA培养基上，25℃通风培养20d左右，待长出菌丝体后，存于4℃冰箱备用[7]。

1.3.3 接种及培养方法 选取250mL锥形瓶缓慢倒入100mL已经配好的种子培养液，从制好的菌株中挖取少许菌丝体，加入锥形瓶中，25℃、140r/min条件下培养5d，制成种子液。选取500mL锥形瓶加入150mL发酵培养液，接入15mL种子液，25℃、140r/min条件下培养6d[7]。

1.3.4 多糖的提取及测定 参加文献[8-9]。

1.3.5 单因素试验 对碳源的5个水平（葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、玉米粉），氮源的5个水平（牛肉膏、蛋白胨、黄豆粉、氯化铵、硝酸铵），无机盐的5个水平（磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、氯化钙）分别进行发酵培养并测定栗蘑多糖含量，各因素均设有对照组，每一水平均设有3个平行实验。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）试验设计 根据前期单因素试验，选用N=12的Plackett-Burman（PB）试验设计，对黄豆粉（A）、玉米粉（B）、葡萄糖（C）、磷酸二氢钾（D）、硫酸镁（E）和蛋白胨（F）这6个因素进行编排组合并通过试验进行筛选，同时增加5个虚拟变量。每个因素取“一高一低”2个水平，以栗蘑多糖的含量（g/L）为响应值，如表1所示。

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

1.3.7 最陡爬坡试验 用最陡爬坡法可以快速有效地进入最优点所在的临近区域。而且可以根据Plackett-Burman（PB）试验结果中筛选出的显著因子的效应大小来确定最陡爬坡试验的方向和梯度，其他因素均取最大值，测定栗蘑多糖含量的变化趋势，确定后续试验因素的中心。

1.3.8 Box-Behnken Design响应面优化 根据上述Plackett-Burman（PB）试验设计和最陡爬坡试验中确定的试验因素及最佳点，采用Box-Behnken Design法进行3因素3水平的响应面优化，以此得到最佳的配方，如表2。

1.3.9 验证试验 将优化后的液体发酵培养基配方配置成培养液，以10%的接种量接入栗蘑菌种25℃，140r/min条件下培养6d，测定栗蘑多糖的含量，并重复3次。 2 结果与分析

2.1 单因素试验结果 单因素碳源、氮源、无机盐对栗蘑多糖的含量均有影响，如图1所示。由图1可知，玉米粉、磷酸二氢钾、蛋白胨3种因素对栗蘑多糖含量的影响较为明显，为进一步确定发酵培养条件的最佳用量，需通过响应面进一步优化。

2.2 Plackett-Buman试验筛选显著因子 Plackett-Buman实验设计和结果见表3，因素效应分析和重要性评估见表4。从表4可以看到，A（黄豆粉）、B（玉米粉）、C（葡萄糖）、D（磷酸二氢钾）、E（硫酸镁）、F（蛋白胨）这6个因素的系数均为正数，即A、B、C、D、E、F这6个因素对栗蘑多糖含量影响都是正效应，也就是说随着这些因素水平的增加，栗蘑多糖含量逐渐增加。6个因素对实验结果的F值（贡献率）的大小排序依次为：D（磷酸二氢钾）>F（蛋白胨）>B（玉米粉）>E（硫酸镁）>C（葡萄糖）>A（黄豆粉）。其中磷酸二氢钾的P值小于0.01，影响极为显著；蛋白胨和玉米粉的P值小于0.05，影响显著。所以选用这3个因素作为主要的研究对象作后续研究。

2.3 最陡爬坡试验确定最大相应区域 对Plackett-Buman实验筛选出的显著因子玉米粉、磷酸二氢钾、蛋白胨进行最陡爬坡试验，3个因子对栗蘑多糖含量的影响均为正效应，所以各个因素梯度为上升方向。试验设计见表5。

通过表5可以得到，随着玉米粉、磷酸二氢钾、蛋白胨浓度的增加，栗蘑多糖含量呈现先上升后下降的趋势。栗蘑多糖含量出现最大值是在试验3中，所以该处是最大的影响区域。因此选用此条件作为后续响应面的中心点。

2.4 多元二次回归的模型建立及分析方差 以玉米粉、磷酸二氢钾、蛋白胨3个因子作为为变量并分别标号为X、Y、Z，以栗蘑多糖含量作为为响应值，设计3因素3水平的Box-Behnken Design试验。以上数据均通过Design-Expert 7.1.6软件辅助完成并进行分析，设计和结果见表6。

利用Design-Expert 7.1.6软件对上表中数据进行编程，得到回归方程：

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

由表7进行回归模型的方差分析。

通过方差分析可以看出，该模型的Prob>F值是F值是0.760 6，大于0.05表明失拟项不显著，说明模型在整个回归区域内有很好的拟合度，与真实的响应面情况接近，说明模型建立合理。CV表示模型的精确度，CV值越低，说明模型可信度越高，本次试验模型的CV=0.17%比较低，可信度高，表明试验可以信服。模型的决定系数R2=99.53%，说明预测值和实际值间具有高度相关性，能解释的响应值变化，所以可以用此模型对栗蘑多糖的含量进行测量。 2.5 响应面交互作用分析及寻求最优点 根据表6绘制S随X、Y、Z变化关系的响应面立体图，如图2所示。由图2可知，S值（栗蘑多糖含量）在试验区有最大值。通过建立的回归的模型可以估测，S的最大值为2.49g/L，此时X（-0.55）、Y（0.47）、Z（-0.06）即玉米粉17.25g/L、磷酸二氢钾2.237g/L，蛋白胨5.88g/L。

从响应面的最高点和等值线可以直观的看出，在所选范围内存在极值，也就是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。当蛋白胨位于中心点时，磷酸二氢钾添加量对响应值峰值的影响较玉米粉添加量影响大，当磷酸二氢钾处于中心点时，玉米粉的添加量对响应值峰值的影响较蛋白胨添加量影响大；当玉米粉处于中心点时，磷酸二氢钾的添加量对响应值峰值的影响较蛋白胨添加量影响大。响应面图分析与方差分析相符，表明通过本试验建立的栗蘑多糖液体发酵培养基模型是合适的模型。

2.6 拟合优化的验证 为验证响应面法所得结果是否可靠，在上述条件下经3次重复试验验证，预测值与验证值接近，实际测得的栗蘑多糖含量为2.48g/L，与估测值相比，其相对误差很小。因此，通过响应面法所得的栗蘑多糖发酵培养基参数准确可靠，所建立的模型可信度良好。 3 结论

通过试验证明，响应面分析方法对该栗蘑菌株液体发酵条件的优化具有良好的效果。本次研究经响应面方法优化得出栗蘑多糖的最佳发酵工艺条件为：黄豆粉15g/L、玉米粉17.25g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾2.237g/L、硫酸镁2g/L、蛋白胨5.88g/L，并在pH自然、25℃、140r/min条件下培养，发酵栗蘑多糖含量为2.48g/L，比优化前产量提高了76.03%。 参考文献

[1]邓媛，李皎，杨国武，毛勇，等.响应面法优化多黏芽孢杆菌产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵培养基[J].中国食品添加剂，2015（1）：64-70.

[2]郭云霞，吴国江，魏萌，等.响应面法优选N-14菌株发酵黄芪总多糖的工艺条件[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（5）：38-41.

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

[3]刘丽莎，陶国琴，郭宏，等.响应面法优化豆乳链球菌增殖培养基[J].食品科学，2014，35（11）：124-128.

[4]张泽生，祖玉姣，余悦，等.响应面法优化春雷霉素发酵培养基及培养条件[J].中国抗生素杂志，2014，39（8）：584-589.

[5]李磊，王卫国，郭彦亮，等.灰树花多糖的制备及其生物活性研究进展[J].食品工业科技，2009（11）：327-331.

[6]叶晶晶，曹宁宁，刘刚，等.蛹虫草液体发酵培养基的优化[J].浙江农林大学学报，2014，31（3）：465-472.

[7]吕冬霞，杜伟，范晓艳，等.灰树花多糖联合顺铂对H22肝癌移植瘤小鼠的抑瘤作用研究[J].中国老年学杂志，2014，（8）：2165-2166.

[8]贺莹，高丽芳，焦红英.黑曲霉产糖化酶固态发酵营养条件优化研究[J].中国酿造，2013（9）：88-90.

[9]易明花，邬晓燕，郭薰璟，等.培养基优化提高灰树花胞内多糖产量的研究.湖北农业科学[J]，2014，53（6）：1378-1381. （责编：张宏民）