不同提取方法对黄连中小檗碱含量的影响

不同提取方法对黄连中小檗碱含量的影响

【摘 要】本实验对不同提取方法对黄连中小檗碱含量的影响进行研究。方法：采用奥泰公司C18色谱柱（220mm×4.6mm，5μm），甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）为流动相，检测波长为265nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。小檗碱在0.05～0.55mg·mL-1范围内呈良好的线性关系（r=0.99995）。小檗碱平均回收率分别为99.5%。结论：本法简便、准确，可用于黄连中小檗碱的含量测定。实验结果表明回流法、超声法、回流超声法三种提取方法间均有显著性差异。

【关键词】小檗碱；含量；测定

黄连，多年生草本植物，属毛莨科黄连属。黄连始载于《神农本草经》，列为上品，因其根茎呈连珠状而色黄，所以称之为“黄连”。《新修本草》记载：“蜀道者粗大节平，味极浓苦，疗渴为最；江东者节如连珠，疗痢大善。今澧州（今湖南澧县）者更胜。”黄连具有清热燥湿，泻火解毒的功效。黄连常用于湿热痞满、泻痢、黄疸、心火亢盛、血热吐衄、牙痛、痈肿疔疮、湿疮等。黄连含有黄连素（Berberine）、木兰花碱（Magnoflorine）、黄连碱（Coptisine）、甲基黄连碱（Worenine）、黄柏内酯（Obakulactone）、非洲防己碱（Columbamine）、阿魏酸（Ferulic acid）等。本实验对不同提取方法对黄连中小檗碱含量的影响进行研究。

1.仪器与试药

（1）仪器：ULABO实验室温度控制器（优莱博技术（北京）有限公司）；SCQ-25-6声彦分体式超声波清洗机（上海声彦超声波仪器有限公司）；海能仪器LC7300 HPLC一体等度系统（济南海能仪器股份有限公司）；CPX2800H-C必能信超声波清洗器（必能信超声（上海）有限公司）；SP-1920双光束紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；Precisa EP8200C 电子精密天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；XSYF-D实验室废水处理设备（北京湘顺源科技有限公司）。

（2）色谱柱：奥泰公司C18色谱柱（220mm×4.6mm，5μm）。

（3）对照品：小檗碱

（4）试剂：甲醇（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）、醋酸钠（上海泰坦科技股份有限公司）、磷酸二氢铵（阿拉丁试剂（上海）有限公司）、冰醋酸（阿拉丁试剂（上海）有限公司）、三乙胺（上海一基生物试剂有限公司）、庚烷磺酸钠（上海一基生物试剂有限公司）、乙腈（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）。

（5）试药：黄连

2.测定方法确定

2.1色谱条件

依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-5]。流动相：甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）为流动相，检测波长：265nm，流速：1.0m·min-1。柱温：30℃。理论板数按小檗碱峰计算应不得低于2000。

2.2对照品溶液的制备

精密称取小檗碱对照品适量，置容量瓶中，加流动相制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

2.3.1回流法

将黄连粉碎，过40目，称取适量，置圆底烧瓶中，精密加入1%盐酸甲醛溶液50mL，精密称定重量，加热回流40分钟，放冷，精密称定，用1%盐酸甲醛溶液补足重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.3.2超声法

将黄连粉碎，过40目，称取适量，置具塞锥形瓶中，精密加入1%盐酸甲醛溶液20mL，密塞，精密称定重量，超声处理20分钟，放冷，精密称定，用1%盐酸甲醛溶液补足重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.3.3回流超声法

将黄连粉碎，过40目，称取适量，置圆底烧瓶中，精密加入1%盐酸甲醛溶液50mL，精密称定重量，加热回流20分钟，放凉，再超声处理20分钟，放冷，精密称定，用1%盐酸甲醛溶液补足重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.4精密度试验

精密称取小檗碱对照品适量，加流动相使溶解，制成浓度为0.1mg·mL-1的供试品溶液。照上述色谱条件，精密吸取10μl，连续进样6次，记录峰面积。结果，RSD=0.66%，表明本方法精密度良好。

2.5对照品的线性考察

精密称取适量小檗碱对照品，加入流动相溶液使溶解分别配制成每毫升含0.05、0.1、0.15、0.25、0.35、0.4.、0.45、0.55毫克的溶液。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照2.1项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以

峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，小檗碱在0.05～0.55mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.6重现性试验

称取同一批的小檗碱样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.65%，结果表明此方法的重现性良好。

2.7准确度试验

取对照品适量，精密称取已知含量的样品9份，置量瓶中，分别精密加入小檗碱对照品，按项下方法制备成80%100%、120%。取模拟样品照“ 含量测定” 项下方法试验，计算回收率为99.5%，RSD为0.65%。

2.8样品含量测定

依照上述含量测定方法，再按外标法以峰面积计算样品的含量，结果回流法、超声法、回流超声法三种方法提取方法所提样品的含量分别为7.51%、7.53%、7.53%。实验结果表明回流法、超声法、回流超声法三种提取方法间均有显著性差异。

3.讨论

分别考察0.04mol·L-1磷酸二氢铵溶液-乙腈-三乙胺（60∶40：0.01），甲醇-1%冰醋酸溶液（28∶72），甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶20：60：0.05：0.1），甲醇-0.01mol/L醋酸钠溶液-0.04mol/L庚烷磺酸钠-冰醋酸-三乙胺（20∶40：40：0.01：0.01），甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）不同比例的流动相，结果以甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）为流动相为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）为流动相为流动相。本实验采用高效液相法效果好、方法简便、快捷、准确、专属性好，可用于黄连中小檗碱的含量测定。实验结果表明回流法、超声法、回流超声法三种提取方法间均有显著性差异。

【参考文献】

[1]匡艳辉，朱晶晶，王智民，张启伟.一测多评法测定黄连中小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱含量[J].中国药学杂志，2009（05）.

[2]黄小平，张毅，钟国跃.不同产地和生长年限黄连的总生物碱含量测定[J].现代中药研究与实践，2004（01）.

[3]应懿，何志红，周世文，汤建林，杨雪，王璐.测定黄连中5种生物碱含

量的高效液相色谱法研究[J].第三军医大学学报，2007（09）.

[4]向莉，李盾.HPLC法研究黄连中表小檗碱等五种生物碱的含量[J].成都中医药大学学报，2004（02）.

[5]袁久荣，魏英勤，袁浩，徐娟，容蓉.RP-HPLC法同时测定黄连中四种原小檗碱型生物碱的含量[J].世界科学技术，2006（06）.