卫生微生物学实验指导
（仅供预防医学本科教学使用）
姓 名 年 级 班 级 指导老师
卫生微生物学实习指导
实验一 自来水中指示微生物的检测 — 菌落总数的测定
目的及意义
掌握菌落总数实验的基本原理和意义；熟悉水样采集要求，熟悉菌落总数实验的全部过程和具体操作方法；了解无菌操作和避免污染的概念。
根据不同目的，选择有代表性的一种或一类微生物，对检测、研究对象中的该微生物状态进行定性或定量的描述，并赋予其特定的标志意义，这类微生物即所谓的指示微生物。指示微生物在污水与饮用水处理、环境监测、产品质量控制、消毒灭菌、卫生监督等领域广泛应用。最常用的为菌落总数和大肠菌群，菌落总数用于评价被检测样品的一般卫生微生物学质量，即微生物污染程度和安全性。
菌落总数是指被检测样品在单位重量（g）、溶剂（ml）、表面积（cm2）或体积（m3）内，所含有的能在某种培养基上经过一定条件培养后生长的微生物菌落总数。
仪器设备和试剂
1.仪器设备 电子天平、pH计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台。
2.器材和试剂 100-1000μl移液器、1000μl吸头、广口旋塞试剂瓶、培养平皿；1.5%硫代硫酸钠溶液、营养琼脂。
实验方法
一、样品来源
内蒙古医科大学金山校区C座自来水 二、实验准备
1. 配置1.5%硫代硫酸钠溶液
2. 取400μl 1.5%硫代硫酸钠溶液加入容积为250 ml的蓝盖试剂瓶中，该瓶作为为取样
瓶（硫代硫酸钠的作用是中和自来水中的消毒剂）。 3. 准备3个洗干净的培养平皿，用报纸包严。 4. 配置80ml固体营养琼脂。
5. 将上述取样瓶、营养琼脂和培养平皿101.3kPa高压蒸汽灭菌20分钟。 6. 灭菌过程中将超净工作台或无菌室打开紫外灯照射30min。 三、样品采集
1.先对欲采集样品的水龙头进行消毒，然后将水龙头完全打开，放水5分钟后收集样品，采水量为瓶容量的80%左右。
2.采样后及时做好标记，开始检测。
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四、检测步骤
1.将水样用力摇20～25次，使微生物充分的分散开来。 2.分别稀释水样10倍、100倍、1000倍与水样原液一起待检。
3.取两个干净无菌的空平皿，分别标注“1”和“2”。在1号平皿中加入1ml水样后倾注15～20ml已熔化并冷却45℃左右的营养琼脂，并立即旋转平皿使水样与琼脂充分混匀（顺时针旋转3次、逆时针旋转3次、左右前后各晃3次，注意动作不可太大，避免损失），然后将平皿放在水平面上待凝，同样的方法制备2号平皿。再取一个干净无菌的空平皿，只倾注营养琼脂做空白对照。
3.待平皿内培养基冷却凝固后翻转平皿，使底面向上，37℃培养48小时后取出，计数平皿内的菌落数目。
结果分析
分别计数1号平皿和2号平皿里的菌落总数，取平均菌落数即为1ml水样中的菌落总数，并参考表1-1、1-2判断该水样是否符合微生物限量标准。
组 别： 检测水样的稀释度： 1号平皿菌落总数： 2号平皿菌落总数： 该自来水中每毫升可检出的菌落总数是多少？请给出计算步骤。
讨论
1.利用本实验方法是否可测得水中的全部细菌？为什么？
2.本方法为什么主要是检测细菌菌落数，而不是霉菌或酵母菌？
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3.菌落总数主要是作为判定受检水样污染程度的标志，以便对水质进行卫生学评价时提供依据。能否根据菌落数多少判断被检样品致病性强弱？为什么？
4.如果改变培养基成分、培养时间或培养温度，菌落数或菌落种类是否也随之改变？
5.请写出硫代硫酸钠中和自来水中消毒剂的反应方程式
表1-1 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系
水的类别 菌落总数（CFU/ml） 最清洁水 10～100 清洁水 100～1000 不太清洁水 1000～10 000 不清洁水 10 000～100 000 极不清洁水 >100 000
表1-2 我国颁布的有关饮用水的微生物限量标准
项目
菌落总数（CFU/ml） 大肠菌群（CFU/100ml） 霉菌、酵母菌及致病菌
GB5749-1985 100 30 不得检出
GB8537-1995 50 0 不得检出
GB17324-2003 20 3 不得检出
GB5749-2006 100 不得检出 不得检出
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实验二 细菌质粒提取及其图谱分析
目的及意义
掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法。由于细菌质粒特征相对稳定，不同菌株的质粒数量、大小及酶切后DNA片段电泳图谱具有相对特异性，因此质粒图谱分析可用于细菌的鉴定和分型。
质粒图谱分析 (plasmid profile analysis, PP分析)是根据质粒DNA电泳条带所构成的特征性图谱来分析质粒和菌株特性的技术，包括质粒指纹图谱和质粒酶切图谱。质粒指纹图谱分析是对提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，不同菌株质粒数目和分子量大小不同而呈现不同电泳条带所组成的图谱，比较电泳条带数目和大小异同，分析不同菌株质粒的数目和分子量大小特征。
现从某水源水样品中分离出两株大肠杆菌，已知这两株细菌的形态、大小及生化特征都比较相似，请用质粒图谱法进行鉴定这两株细菌是否是同一菌种。
基本原理
碱裂解法是一种相对剧烈的裂解细菌的方法，适用于小质粒 (<15kb) 的分离提取。菌体在NaOH和SDS的作用下被裂解，细菌的蛋白质变性，同时释放出质粒DNA和基因组DNA，两种DNA在强碱环境中都发生变性。由于质粒和基因组的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开，但后者完全变性分开甚至出现断裂。因此，当使溶液pH值恢复近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是基因组染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分基因组染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
仪器设备和试剂
仪器 超净工作台，恒温培养箱，震荡培养箱，台式高速离心机，，漩涡振荡器，电泳仪及水平琼脂糖电泳设备，凝胶观察成像系统，-20℃冰箱等；
器材 培养平皿，10ml试管，1.5mlEP管，100-1000μl微量移液器，10-200μl微量移液器，计时器，吸水纸等；
试剂 LB固液培养基，质粒提取用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，无水乙醇，超纯水，电泳缓冲液，上样缓冲液，溴化乙锭 (EB) 核酸染料，DNA Marker，溴酚蓝； 菌株 大肠埃希菌DH5α (含有pBR322-LEU) 和大肠埃希菌V517。
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实验方法
对A，B两株细菌进行质粒分型
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落（A，B），并分别接种于5ml LB（含Amp100μg/ml）液体培养基中，37℃、180rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。
2. 取1.5ml培养液于1.5ml EP管中，12000rmp离心1min。弃上清，尽量除尽培养液。 3、加入100μl溶液Ⅰ (配方见附表) 重悬菌体 (剧烈振荡，使菌体分散混匀),室温放置5min。 4、加入新配制的溶液Ⅱ (配方见附表) 200μl，盖紧管口，快速温和颠倒6次(千万不要振荡)，冰浴5 min。
5、加入200μl预冷的溶液Ⅲ (配方见附表) ，盖紧管口，将管温和颠倒数6次混匀，见白色絮状沉淀，在冰上放置5min。
6、4℃，12000rmp离心10min。上清液移入干净EP管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀, 12000rmp离心10min。（500μl的苯酚/氯仿/异戊醇。）
7、小心移出上清于一干净EP管中，加入1ml预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃，12000rmp离心10min。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，1ml 70％乙醇洗沉淀两次。 9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl 无菌超纯水中，标记好，4℃冰箱保存待电泳观察结果。
11、配制1％琼脂糖凝胶，将称好的琼脂糖粉放入三角烧瓶中，加入1×TBE缓冲液，摇匀后放入微波炉中煮沸三次，凉至不烫手时加入EB（终浓度0.5μg/ml）摇匀，倒入提前插好梳子的胶板槽中，置于平面上待凝。
12、将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入适量的1×TBE缓冲液，取5μl质粒溶液混入1μl溴酚蓝上样，调整电压(80V，200A)，开始电泳。
13、待样跑至距离凝胶边缘约1厘米时停止电泳，将胶置于紫外成像仪下观察结果。
结果分析
组别:
根据实验质粒电泳条带的位置并对照DNA Marker，绘制质粒图谱并估测质粒分子量大小。（E.coliV517含8个质粒，分别为54.4、7.3、5.6、5.2、4.0、3.0、2.7、2.1kbp）
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结果讨论:
讨论
不同菌株带有分子量相同的质粒，可以认为这些质粒一定是相同的吗？如何进一步验证？
注意事项
EB为致癌剂，本实验中凡是接触到该试剂的操作步骤都应戴PE手套。
附表
（1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) , 10 mmol/L EDTA (pH8.0) , 配制200ml。
取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，双蒸去离子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高压灭菌后4℃保存。 （2）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。 配制100 ml，现用现配。
10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至100 ml，室温保存。 （3）溶液III：配制100 ml。
5 mol/L 乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，双蒸去离子水28.5 ml。
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实验三 综合设计实验
本次实验给出两个题目，学生自选题目并提前预写实验报告，学生可利用网络、图书馆等平台进行资料查找。
题目 一：检测实验室空气中是否存在溶血性链球菌；
题目 二：鉴别菌液，实验室有两瓶不同的菌液，由于操作者疏忽忘记标记名称，现无法区分。已知其中一瓶为金黄色葡萄球菌，另一瓶为铜绿假单胞菌。请设计一个实验帮助该实验者区分开两种菌液；
注：受实验条件限值，请学生设计时要对可行性、可操作性、灵敏度、实验时间、所需成本等方面进行综合考虑。
组 别： 实验题目： 实验原理
所需仪器设备和试剂
试验方法
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预期实验结果分析
实验结果讨论
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