细菌内毒素检查法标准操作规程

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1.目的

建立细菌内毒素检查法的操作标准，以免操作不当而造成损失及减少误差的来源。 2.范围

本规程适用于各品种的细菌内毒素检查。 3.职责

QC负责本规程的实施，QC主管对本规程的实施进行监督。 4.内容

4.1实验材料及用具

4.1.1天平（精度0.1mg）；电热干燥箱（用于去除外源性内毒素，温度应能达到250℃）；恒温水浴箱货适宜的恒温器（37℃±1℃）；水银温度计或酒精温度计（精度1℃以下）；旋涡混合器；鲎试剂（应有国家主管部门的批准文号）； 4.1.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品；

4.1.3细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。

4.1.4实验用具：移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%乙醇棉、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤30分钟以上。若使用塑料器械、如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。 4.2实验准备

4.2.1玻璃器皿的洗涤：将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置人电热干燥箱。

4.2.2玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除：玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250℃，待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250℃干烤30分钟以上。达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。 4.2.3供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品的PH值在6.0~8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用

酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 4.3操作方法

4.3.1鲎试剂灵敏度复核

鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。

因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰试验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。 4.3.2实验操作

4.3.2.1细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。

按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min。然后进行稀释，制备成4各浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒种。

若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装、保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用。 4.3.2.2待复核鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml、支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18支管备用。 4.3.2.3加样

将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每支分别加入0.1ml2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 4.3.2.4加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡。连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保存水平状态，保温60min±2min。

4.3.2.5观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出

缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 4.3.3实验结果计算

当最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）

λc =lg-1（∑X/4）

式中：X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。 4.3.4结果判断

当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。