青霉植酸酶生产条件及纯化的研究

第２３巷第２期　华南农业大学学报（自然科学版）　Ｖ　．，３，　ｏ　２　２００２年４月　Ｊｏｕｎｒａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈ　ｃｈ　Ａ　ｃＵｌｔｌ￣ｒ￣ｄ　Ｕｒｄｖｅｍｌｔｙ（ＮａｔｔＬｒａｌ　５ｃｉｅａｃｅ　Ｅｄｉｉｔｏｎ）　ＡＤｒ．２０阻　文章编号：１００１—４１ｌｘ（２ＯＯ２）０２　ＯＯ４４—０３　青霉植酸酶生产条件及纯化的研究　何平　，傅雪琳　，詹福建‘，赵亚华　，高向阳　，许少杰，　（１华南农业太学生命科学学院．广东广州５１０６４２；２华南农业太学农学院，广东广州５１０６￣２）　摘要：青霉培养液的原始ｐＨ值为５．５时．植酸酶大量地产生．酶活性高在青霉的生长过程中．维持培莽液ｐＨ的不　降低会抑制青霉的生长．植酸钙可促进植酸酶　眭的提高．桓酶液经硫酸镄分圾沉淀，再经Ｓｅｐｔｍｄｅｘ　Ｇ一１００凝胶　过滤．洗脱液有２个具有酶活力的蛋白峰，植酸酶被纯化了３．３倍．比活力达７１．３　Ｕ／ｎｔｇ．　关键词：青霉：植酸；植酸酶　中圈分类号：Ｑ９３６　文献标识码：Ａ　自从１９０７年Ｓ【ｌｚｕｈｉ在米糠中首先发现了植酸酶　萄糖＋３０　ｇ・Ｌ　琼脂＋稀释ｌ０倍的培养基母液，５　（ｐｈｙ￣ａｓｅ）之后，专家们就对动植物体内的植酸酶进　ｇ－Ｌ　植酸钙，ｐＨ　５．５．溶解后倒入培养皿，玲却后　行了长期的研究．到目前为止，人们已经发现植酸酶　划线培养，３ｏ℃，３～５　ｄ．　存在于细菌、部分真菌及植物中　－　．由微生物发酵　（３）液体培养基的制备　及培养方法：３ｏ　ｇ－Ｌ　葡　生产的植酸酶才具有真正的开发价值，目前的研究　萄糖＋２Ｏ一８０　－ＬＩ１淀粉＋３　ｇ－Ｌ　植酸钙＋稀释　主要集中在微生物上从６ｏ年代末以来，人们陆续　１０倍的培养基母液，ｐＨ　５．５．５００　ｍＬ三角瓶中装液　从十几种微生物中分离到植酸酶．如枯草孢杆菌　体培养基１００　ｍＬ，高压灭菌冷却后，在固体培养基　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｈ￣），假单孢杆菌（Ｐｓｅｕｄｖｍｏｎａｓ），大肠杆　上挑取３环青霉菌到液体培养基，于３０℃、１２０　ｒ／ｎｆｉｎ　菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ），酵母（Ｓａｃ，－ｈａｒｏｍ）ｖｅｓ），曲霉（　．　振荡摇床上培养５—７　ｄ　ｐｅｒｇｇｔ￣），青霉（　ｒｄｃｉｌｌｍｍ）　一等．　１　３植酸酶检测方法…　植酸酶主要应用在饲料上，在动物饲料中添加　在固体培养基上挑取３环青霉菌到液体培养　植酸酶，不仅为动物提供所需的磷，而且通过解除螯　基，３ｏ℃振荡培养，将苗液在１０　０。Ｏ　ｒ／ｒａｉｎ室温下离　合作用提高动物对矿物元素及蛋白质的利用率，促　心５　ｍｉｎ，取上清液作为粗酶液．取酶液０．５　ｍＬ加底　进动物生长发育，减少环境污染．国外现已开始试用　物溶液（０．２５　ｎｗｌ／Ｌ乙酸一乙酸钠，１　４　ｇ－Ｌ　植酸，　食品级植酸酶处理粮食，以分解粮食中的植酸（盐），　ｐＨ　５．０）１．５　ｍＩ＿，４５℃保温３０ｍｉｎ，立即加１ｏｏ　ｇ－Ｌ　三　减少植酸对微量元素的螯合，以提高粮食的营养价　氯乙酸（ＴＣｋ）水溶液１　ｍＬ，定磷试剂　３　ｍＬ，在６６０　值Ｉ　一　．　ｉｌｒｌｌ波长下测定，Ｊ∞　值．以每毫升粗酶液作用ｌ　ｒａｉｎ　利用微生物发酵生产植酸酶，目前的研究主要表　放出ｌ　ｎｍ　ｎＩ无机磷的酶量为１个酶活力单位（ｕ）．　现在筛选诱变产酶菌种，另一方面通过改变发酵条件，　１．４植酸酶的部分分离纯化　提高产酶率Ｌ　．笔者对产植酸酶的青霉菌（Ｐｅｎｉｃｄｌｉｕｍ　（１）硫酸铵分级分离：将发酵液（２００Ⅱ１Ｌ）在室温　ｓＰ）的生长条件及其酶学特性进行了研究．　下以４０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒａｉｎ，在１０％～１００％硫酸铵　饱和度下测定植酸酶活力的变化．　１材料与方法　（２）ｓｅ口ｈａｄｅｘ柱层析：经硫酸铵分级分离后，在　１．１菌种　３ｏ％和７０％饱和度各有一酶活性组分，其中７０％饱　青霉菌（Ｐｅｒｄｃｉ￣ｌｉｕｍ　ｓｐ．）是从鸡粪的垃圾堆中筛　和度酶活性较高，取７０％饱和度下的组分，上　选出分泌植酸酶的菌种．其培养条件见文献１］ｊ　Ｓｅｐｈ，￣ｄｅｘＧ一１００柱（２．５㈨ｘ　２０　ｃｍ）层析，以ｐＨ　４　５、０．２０ｍｏ／／Ｌ乙酸～乙酸铺缓冲液，９２，０ｍＬ／ｈ速度　１．２培养基及培养方法　洗脱分离，每管收集量为３　ｍＬ．在２８０　ｔｉｍ波长下检　（１）培养基母液的制备：５　ｇ。Ｌ　Ｍ　０４。７ｍ０＋　测收集结果，并测定酶活力．　５０　ｇ　Ｌ－。Ⅳ　＋５　ｇ　Ｌ　ＫＣｉ＋ｌ　ｇ　Ｌ　ＭｎＳｑ　１．５蛋白质的测定　２　Ｏ＋０．１　ｇ・Ｌ一　ＦｅＳＯ￣－７　０，使用时稀释ｌ０倍．　按Ｂｒａｄｆｃ，ｄ方法ｌ　Ｊ．并以牛血清白蛋白为标准　（２）固体培养基的制备及培养方法：１５　ｇ－Ｌ　葡　蛋白质　收稿日期：２００１～０９—１８　作者简介：何平（１９６７一），男　讲师，硕士　基金项目：华南农业太学校长基金资助项目（９９００３）　维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　何平等：青霉植酸酶生产条件及纯化的研究　２结果与分析　底物供应时，植酸酶活性较低，而当提供植酸钙（浓　度为５　ｇ・ＬＩ１）时，植酸酶活性大幅度的提高当植酸　２．１培养液原始ｐＨ对产酶的影响　酶活性大幅度的提高后，分解植酸提供大量的磷，过　将培养液的ｐＨ分别调为２　０、３　５、４．０、４．５、５　５、　量的磷反过来又抑制植酸酶的活性，故而其活性叉　６．５，青霉接种培养．从图１可以看出当培养液原始　降低．　ｐＨ为５．５时，植酸酶活性最高，因此青霉培养液的原　始ｐＨ值为５．５最佳．　三　萎　萋言　《　；　主　阿３植酸钙对植酸酶活性的促进作用　掣接盛蔷　Ｈ８　３　Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｉｍｎ　ｐＩｌｙｔａｔｅ　ｏｎ　一　ｐｈｙ＿］　—ｔ董Ｌａｓｅ　ａＥ一【乱　螺崔督掣　ｃｆ【１ｉＥｊ｝ｖ４．ｉｆ　ｅｓ三一　＾Ｔ　≈　２．４植酸酶的部分分离纯化　Ｉ／ｈ　用青霉发酵的酶液，过滤后，经硫酸铵分级分　图１培养液ＰＨ与植酸酶活性的关系　离，在３０％和７０％饱和度各有１个酶活力组分（图　Ｈｇ　１　ｒｅｌａｔｉｏｎｓ｝ｌｉｐ￣［ｗｅｌ２ｎ　ｐＨ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｌｕｉｄ　ａｎｄ　４），取７０％饱和度的酶液，上Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一１００柱，洗　ｐｈｙｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　脱液呈现２个蛋白峰，两峰均有植酸酶活力，第二峰　２　２乙酸一乙酸钠缓冲液对青霉生长的影响　酶活力相对较低（图５）．植酸酶分离纯化结果如　表１．　在　蒸留水　０倍稀释的培养基母液中，高压灭　菌后（ｐＨ　５．５），进行青霉的摇瓶培养，随着青霉培养　时间的延长，培养液ｐＨ缓慢降低，最终降至２左右；　在２４—３０　ｈ时菌液ｐＨ降低迅速，随后有大量的植酸　酶分泌…．而以ＤＨ　５．０、０．１０ｍｏｌ／Ｌ乙酸一乙酸钠　缓冲液取代蒸馏水ｌ０倍稀释培养基母液，进行青霉　的摇瓶培养时，培养液的ｐＨ基本不变，通过观察发　现，在一开始的２４　ｈ内菌丝体的生长与对照相似，但　在２４　ｈ后其菌丝体不见增加，反而慢慢消失，同时检　硫酸铵饱和虚　测不出植酸酶的活性（图２）．因此可认为在青霉的　ａｍｍｏｎｉｌｔｍ　ｓ　Ｉｒａｔｃ　ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ．ｒ％　生长过程中，由于缓冲液保持培养液的ｐＨ不下降，　罔４不同硫酸铵饱和度中青霉植酸酶的恬力变化　会抑制青霉的生长，同时也可能阻遏ｒ酶的合成　Ｆｉｇ，４　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｔｋ　ｐｈｙｔａ，￣ａｃｔｉ，ｉｆｔｙｆｉｒｍ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｍｎｉｎ　ｄｉｆｅｚｅｎｉ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　０　０　０　０　０　０　１　２　２４　３６　４Ｓ　６０　７２　ｌｌ　圜２乙酸一乙酸钠缓冲液对青霉生　中培养液ｐＨ的影响　Ｆｉｇ　２　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　０ｆＫ＆ｃ—ＮａＡｃ　ｂｕｆｆｅｒ　０１１　ｃｕｈｕｒｅｆｌｌｉｌｄ　ｐｆ！ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅ　ｉｌｌｉ岫　２．３植酸钙对植酸酶活性的促进作用　罔５青霉植酸酶％ｖｈＭｅｘ　Ｇ一１００凝胶过滤结果　Ｆｉｇ　５　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｈｅ　ｄ　ａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｂｙ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　如图３所示，当培养液中没有加入植酸钙作为　０ｎ　ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一１００　维普资讯 http://www.cqvip.com

华南农业大学学报（自然科学版）　第２３卷　表１菌株胞外植酸酶分离纯化结果　Ｔａｂ．１　Ｙｉｅｌｄｓ　ａｎｄ印ｅｄ　ａｃｉｔｖｉｔｉｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｍ＇ｉｉｆｅ￣ｌｉａ　ｅ０ｆｅ咖雌ⅡｕＩａｒ￣ａｙｔａｓｅｆｒｏｍ　ｐｅｌｌｉｄｌＩｉＩⅡｎ　从表ｌ可看出，粗酶液经硫酸铵分级分离、上　ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１００柱后，比活力从２１．３　Ｕ／ｒａｇ提高到　７１．３　Ｕ／ｒａｇ，纯化倍数为３．３，回收率为２６．８％．　生长条件的研究［Ｊ：．华南农业大学学报，２００１，２２（３）：　４７—４ｑ．　３讨论　［２］褚西宁，斐武红，袁静明．青霉产植酸酶理化性质的初　步研究［Ｊ　．微生物学杂志，１９９６，ｌ６（１）：５—８　［３］刘德忠．新型酶制剂一植酸酶的应用及开发［Ｊ］　饲料　工业．１９９８，１９（３）：１９—２０　在酶的活力测定时，不能以双蒸水代替粗酶液　［４　姚斌．范云六．植酸酶的分子生物学与基因工程［Ｊｊ．　作为空白对照，因为粗酶液中本身含有无机磷，这样　生物工程学报，２０００，１６（１）：１—５．　测出的酶活性会较高，不真实；使粗酶液中的酶失活　［５］陈强，董平祥植酸酶对鸡、猪生产的作用［Ｊ］中国　饲料，１９９６，ｌ８：１６—１８．　后作为空白对照，这样测出的酶活性才正常．　刘伟．刘心海　等．固态发酵饲用酶制剂的研　从结果还可以看出植酸酶活性的提高，会大量　［６］陆文清，究与应用［Ｊ］．饲料工业，２０００，２１（１）：３７—３９　分解植酸钙，使培养液中的无机磷含量升高，而高古　量的无机磷又对植酸酶有明显阻遏作用，这与黄遵　锡等　Ｊ的报道一致，如想维持较高的酶活性，可适当　［７］黄遵锡，慕跃林．张克昌植酸酶固体发酵条件的研究　［Ｊ］菌物系统，２ｏ０ｏ，ｔ９（１）：１ｏ２—１０６．　滴加ＣａＣ１２溶液，使过剩的磷生成磷酸钙沉淀下来，　饲料，１９９６，１０：２５—２６　降低培养液中无机磷的含量，维持较高酶活性．　［９：张龙翔．张庭芳，李令嫒生化实验方法与技术［Ｍ］．北　用双蒸水透析性之后，总酶活性下降很大，说明该酶　京：高等教育出版社，１９８７．１６４—２２１　对ｐＨ值敏感，在透析中不宜用双蒸水，应用缓冲液透析．　【ｉｏ］ＢＲＡＤＦＯＲＤＭＡ　Ａ　ｒａｐｉｄ　ｄ　ｓｅｍｉｔｉ＇￣ｅ　ｎ￣＇ｔｈｏｄｆｏｒ　ｒｌａ　＊　ｔｉｏｎ　ｏｆ￣ｅｒｏｇｒａｍ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｃｉｐｋ　［ｓ］武溯平植酸酶在动物饲料磷营养中的作用【Ｊ］．中国　参考文献：　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ—ｄｙｅ　ｂ￣，ｄｉｇＥｎ　３Ｊ．Ａｎａｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍ，１９７６，７２：２４８—　２５４　［１］何平，傅雪琳．赵亚华　等．植酸酶生产菌的筛选及其　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈｙｔａｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＦＵ　Ｘｕｅ．１ｉｎ２，ＺＩ－ＩＡＪＮ　Ｆｕ—ｊｉａｎ　，ＺＦＬ￣＿Ｏ　Ｙａ－ｈｕａ１，ＧＡＯ　Ｘｉａｎｇ－ｙａｎｇ　，ＸＵ　Ｓｈａｃ－ｊｉｅ　（１　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡＳ，ｉ￣Ｕｎｉｖ．，Ｇｕａ“乎ｌ１０ｕ　５１０６４２ｔ　Ｃｈｉｎａ；　ＨＥ　ＰｉｎｇＩ，２　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ￣ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ａ　ｃ　Ｕｎｉｖ，Ｇｕａ￣ｂｏｕ　５１０６４２　Ｃｈｉｎａ）　Ａｌ￣＇ｌｒａｃｔ：Ｗｈｅｎｔｈｅ　ｎａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆｔｈｅ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ’ｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｆｌｕｉｄｗａｓ　５．５，ｔｈｅ　ｐｈｙｔａｓｅ　ｗａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄｍｕｃｈ．Ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ＤＨ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｌｕｉｄ　ｄｉｄｎ’ｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅ，ｔｈｅ　ｇｒｏ￣ｈ　ｏｆ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｔａｎ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．Ｃａｌｃｉｕｍ　ｏｈｙｔ￣ｔｅ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｔｎｎｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｅｕｉｃｉａｉｕｍ　ｔｏ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｐｈｙｔａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｗｏ　ｉｓｃｅｎ￣Ｔａｅｓ　ｏｆ　ｐｈｙｔａｓｅ　ｍ　ｐｅｔｄｃｉｌｌｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ａｃｃｅｐｔｅｄ　ａｌｍｌａｏｎｉｔｍａ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｌ￣ｅｉｐｉｔａｔｉｏｎ．ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一１００　ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｐｈｙｔａｓｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　３．３　ｆｏｌｄｓ　ｗｉｈ　ａ　ｔｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ７１．３　Ｕ／ｒａｇ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｅｎｉｃｉＵｉｕｍ；ｐｈｙｔａｔｅ；ｐｈ＞ｔａｓｅ　【责任编辑柴焰Ｊ