烟草青枯病菌的田间快速检测

第３６卷第２期　２０１０年４月　湖南农业大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）　Ｖ＿０１．３６　ＮＯ．２　Ａｐｒ．２０１０　Ｄ０Ｉ：１０．３７２４／ＳＥＪ．１２３８．２０１０．００１９２　烟草青枯病菌的田间快速检测　杜桂萍　，周建国　，邓金奇　，罗宽　，刘丹　，蔡勇　，肖启明　（１．湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南长沙４１０１２８；２．中国大拇指集团湖南大鼎置业有限公司，湖南　长沙４１０００２）　摘　要：用平板菌落计数法确定７种抗菌素对烟草青枯菌生长和抑制杂菌的最高浓度，通过正交试验确定药剂　的最佳组合：安必仙９．９９６ｘ１０～ｔ￣ｇ／ｍＬ、氧氟沙星９．９９０ｘ１０一　￣ｇ／ｍＬ、罗红霉素２．９９８ｘ１０～￣ｔｇ／ｍＬ、头孢拉定　３．０００ｘｌ０一￣ｔｇ／ｍＬ、乙酰螺旋霉素１．９９８￣１０／ａｇ／ｍＬ、克拉霉素２．９９９￣１０一／￣ｇ／ｍＬ、阿奇霉素１．９９９ｘ１０一￣ｇ／ｍＬ．利　用以上最佳浓度配比的选择培养基检测湖南湘西、永卅Ｉ、郴州烟田土样中青枯菌，结果表明：湘西土样中青枯菌　含量较大，永州次之，郴州相对较少，与青枯病发生的严重程度呈正相关，其中加青枯菌拮抗菌肥土壤中的含菌　量明显少于未加菌肥土壤．　关键词：烟草青枯病；抗菌素；选择培养基；检测　中图分类号：￥４３５．７２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００７．１０３２（２０１０）０２—０１９２—０４　Ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｅｌｄ　Ｊｉｎ—ｑｉ　，ＬＵＯ　Ｋｕａｎ　，ＬＩＵ　Ｄａｎ　，ＣＡＩ　Ｙｏｎｇ。ＸＩＤＵ　Ｇｕｉ．ｐｉｎｇ。ＺＨＯＵ　Ｊｉａｎ．ｇｕｏ　，ＤＥＮＧ　ＡＯ　Ｑｉ．ｍｉｎｇ　’　，，（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＢｉｏ－Ｓａｆｅｔｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨＮＡＵ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０１２８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｕｍｂ　Ｇｒｏｕｐ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｄａｄｉｎｇ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ　ｏｆＨｕｎａｎ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ，ｔｈｅ　ｉｎｈａｂｉｔｉｎｇ　ｆｕｎｇｕｓ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｅｒｅ　ｃｈｏｓｅｎ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｔｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｕｎｔ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｃａｐｓｕｌｅ　ｗａｓ　９．９９６ｘ１０一￣ｇ／ｍＬ，ｏｆｌｏｘａｃｉｎ　ｔａｂｌｅｔｓ　９．９９０ｘｌ０￣ｔｇ／ｍＬ，ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｔａｂｌｅｔｓ　２．９９８ｘｌ０一ｌａｇ／ｍＬ，ｃｅｆｒａｄｉｎｅ　ｃａｐｓｕｌｅｓ　，３．０００ｘ１０　ｐｇ／ｍＬ，ａｃｅｔｙｌｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ　ｔａｂｌｅｔｓ　１．９９８￣１０　５￣ｇ／ｍＬｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ　ｔａｂｌｅｔｓ　２．９９９ｘｌ０一￣ｔｇ／ｍＬ，ａｎｄ　ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｃａｐｓｕｌｅ　ｗａｓ　１．９９９ｘ　１　０一ｇｇ／ｍＬ．Ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｅｄｉｍ　ｏｆ　ｔｕｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　ｎｔｉａｂｉｏｔｉｃｓ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｏｌｌ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｒｅａｓ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ．ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ　ｉｎ　ｓｏｉ１　ｓａｍｐｌｅｓ　ｉｎ　Ｘｉａｎｇｘｉ　ｗａｓ　ｌａｒｇｅｒ　ｈａｎ　ｉｔｎ　Ｙｏｎｇｚｈｏｕ．ａｎｄ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｓｍａｌｌｅｒ　ｉｎ　Ｃｈｅｎｚｈｏｕ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ａｄｄｉｎｇ　ｎｔａａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　ｓｏｌｌ　ｗｅｒｅ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｏｍｍｏｎ　ｓｏｉｌ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ　ｑｕｉｃｋｌｙ　ｎｄ　ａｔｏ　ｐｒｅｄｉｃｔ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｗｉｌｔ　ａｓ　ｗｅｌ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｔｏｂａｃｃｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ；ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｅｄｉｍ；ｄｅｔｕｅｃｔｉｏｎ　烟草青枯病对烟草的产量和质量影响极大，是　烟草生产上的毁灭性病害【】之】．烟草青枯病致病菌烟　草青枯罗尔氏菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ是土传细　菌，连作烟田中存在大量病原，易造成严重危害ｐＪ．　目前对青枯病的防治尚无理想药剂和抗病品种ｌ４　Ｊ，　加强土壤中青枯菌的检测可为预防烟草青枯病提　收稿日期：２００９．１２．０ｌ　供有效依据．Ｌｅｅ　Ｙｕｎｇ．Ａｎ等【６】利Ｊ￣ＲＡＰＤ技术获得　青枯病菌特异性片段，经克隆测序后设计特异性引　物进行ＰＣＲ扩增，以检测土壤中的青枯病菌，这种　方法能快速检测出样品中的青枯菌，但不能区分其　中的活菌和死菌，并且检测结果容易出现假阳性．　Ｐｒｉｏｕ等Ｌ７　利用双抗体夹　Ｉ￣，ＥＬＩＳＡ（ＤＡＳ．ＥＬＩＳＡ）来检　基金项目：湖南省烟草专卖局重点项目（０８一ｌ　１Ａａ０３）　作者简介：杜桂萍（１９８２一），女，云南曲靖人，硕士研究生，主要从事烟草青枯病生物防治研究；＋通讯作者，ｘｑｍ－ｘｑｍ＠ｓｏｈｕ．ｔｏｍ　第３６卷第２期　杜桂萍等　烟草青枯病菌的田间快速检测　１９３　测土壤样品中的青枯菌，结果显示３３个国家的２７３　土样：２００９年从湖南郴州、湘西、永州采样各　８份（施用菌肥烟田土样４份，未施菌肥对照土样４　份），储存于４℃冰箱．　培养基：肉汁冻培养基（ＮＡ），参照文献［１　１］方　个菌株均可被成功检测．利用ＥＬＩＳＡ对马铃薯和其　他茄科作物作检测，发现多克隆抗体缺乏足够的特　异性，不仅能够和目标细菌作用，而且能和与目标　菌密切相关的株系、生理小种和生物型作用【８】．土　法配制．　壤中的真菌和腐生细菌较多，增加了土壤中青枯菌　１．２方法　检测的难度，所以配制有效的选择培养基来检测土　壤中的青枯菌尤为重要．针对青枯菌的选择性培养　１．２．１　烟草青枯病田间发病情况调查　基，许多学者根据该菌对不同抗菌素的特定抗性研　运用五点取样法，选择有代表性的烟株作为定　究出各种配方，多数因为菌株抗性的差异或者样品　点株，于发病高峰期进行调查，按病情分级标准，　中腐生菌太多而不能广泛推广使用［８］．Ｇｒａｎａｄａ等【９】　记录发病情况，计算病情指数．取样和分级按全国　在四唑培养基的基础上作了改进，研制出一种半选　烟草行业烟草病害调查分级标准Ｙｃ／Ｔ３９－－１９９６进　择性培养基，这一培养基适合大部分青枯菌生长，　行，病情指数计算按烟草病害药效试验方法Ｙｃ／Ｔ４０　但当土壤中腐生细菌较多时有一定的局限性．张新　—１　９９６进行．　生等【ｌ　０Ｊ利用加抗菌素的培养基检测土壤中的青枯　１．２．２　７种抗菌素对青枯菌生长无抑制作用的最高　菌取得了良好的效果．笔者在上述研究的基础上加　浓度的确定　入一定量的抗菌素，配制出一种可以抑制真菌和绝　分别将０．２５　ｇ氨苄西林胶囊、克拉霉素分散片、　大多数细菌的选择培养基，可以快速地检测出土壤　阿奇霉素胶囊、头孢拉定胶囊和０．１　ｇ氧氟沙星片　中青枯菌的活菌数量，现将结果报道如下．　溶于１００ｍＬ水中，０．１５　ｇ罗红霉素片和０．１　ｇ乙酰　１材料与方法　螺旋霉素片溶于１２５　ｍＬ水中，配制成一定浓度的　母液备用（表１）．分别取每种药剂１、０．５、０．２　ｍＬ　１．１材料　加入１０　ｍＬ牛肉膏培养基中，混匀冷却后加入０．２　烟草青枯病菌Ｖ３，由湖南农业大学生物安全　ｍＬ青枯菌液，各处理重复３次，置３０℃恒温箱中　科学技术学院植物病理室提供，菌液浓度６×ｌ０　培养３　ｄ，记录菌落数．　ｃｆｕ／ｍＬ．　将无菌水和各药剂按１０：０．５、１０：０．２、１０：　供试药剂：氨苄西林胶囊（香港联邦制药厂有限　０．１、１０：０．０６、１０：０．０４、１０：０．０２的体积比稀释（质　公司出品，Ａ），氧氟沙星片（重庆科瑞制药有限责任　量浓度见表１），分别取每种稀释药剂０．５　ｍＬ加入　公司出品，Ｂ），罗红霉素片、头孢拉定胶囊、乙酰　１０　ｍＬ牛肉膏培养基中，混匀冷却后加入Ｏ．２　ｍＬ青　螺旋霉素片（重庆科瑞制药有限责任公司出品，Ｃ，　枯菌液，各处理重复３次，置３０℃恒温箱中培养３　ｄ，　Ｄ，Ｅ），克拉霉素分散片，阿奇霉素胶囊（宜昌长江　记录菌落数．　药业有限公司出品，Ｆ，Ｇ）．　表１　７种抗菌素质量浓度　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　￣ｔｇ／ｍＬ　Ｉ９４　湖南农业大学学报（自然科学版）　２０１０年４月　１．２．３　７种药剂对青枯菌无抑制作用的最佳浓度配　比的确定　１０　￣ｔｇ／ｍＬ　０ｏ：Ｏ．５），克拉霉素４．９９８￣１０　￣ｇ／ｍＬ　（１０：０．５），氧氟沙星３．９９６ｘ１０　￣ｇ／ｍＬ（１０：０．０４）　将７种抗菌素随机分为２组，预先测试每种药　剂的最佳配比浓度．第一组：氨苄西林胶囊，氧氟　沙星片，罗红霉素片，采用正交试验法［１２］，选取Ｌ９（３　）　正交表，按三因素三水平安排实验；第二组：头孢　拉定胶囊、乙酰螺旋霉素片，克拉霉素分散片和阿　和阿奇霉素５．９９４ｘ１０　ｇｇ／ｍＬ（１０：０．０６）．　表２　７种不同浓度抗菌素中青枯菌菌落数　Ｔａｂｌｅ　２　Ｔ０ｂａｅｅｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒ￣ｏｎｃｅｌｌｔｒａｌｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　抗菌素——————————　塑壁　———————一　奇霉素胶囊，选取Ｌ９（３　）正交表，按四因素三水平　安排实验．根据所得结果进行７种药剂最佳组合配　比试验，选取　８（３　）正交表，按七因素三水平安排　实验．采用１００　ｍＬ肉汁冻培养基加２．５×１０－２￣ｔｇ／ｍＬ　结晶紫和２．５×１０　ｇｇ／ｍＬ红四氮唑作为基本培养基，　依次加入正交表中所列抗菌素药量（表３），混匀后取　１０　ｍＬ￣Ｊ１］人培养皿中，冷却后加人０．２　ｍＬ青枯菌液，　每种处理重复５次，置３０℃恒温箱中培养３　Ａ　Ｂ　ｃ　Ｄ　Ｅ　Ｆ　Ｇ　ｄ，用　未加药剂的肉汁冻培养基做对照，记录菌落数，计　算回收率．回收率：（试验平均菌落数／对照平均菌落　，Ｏ卯　卯卯Ｏ数）×１０Ｏ％．　１．２．４土壤中青枯茵的检测　分别取土样１　ｇ￣ＪＨＪｋｌ００　ｍＬ灭菌水中，作３次ｌＯ　倍梯度稀释，留１０－３稀释液备用．利用试验得出的　最佳抗菌素药量组合制成培养基，培养皿中倒人１　Ｏ　ｍＬ，冷却后分别加入各地土壤悬浮液０．２　ｍＬ，各处　理重复３次，３０℃恒温培养３　ｄ，记录菌落数，按平　板菌落计数法计算土壤中含菌量．每毫升溶液细菌　数＝平板菌落数×稀释倍数／平板上加菌液的量　（ｍＬ）．计算各地４份土样的青枯病菌平均值．　１．３数据分析　试验数据用Ｅｘｃｅｌ进行处理，用ＤＰＳ７．０５统计软　件进行分析．　２结果与分析　２．１　不同抗菌素对青枯菌生长无抑制作用的最高　浓度　青枯菌在７种不同浓度抗菌素培养基中的生长　情况（表２）表明，对青枯菌无抑制作用抗菌素的最高　质量浓度为：氨苄西林１．９９９ｘ１０－２ｇｇ／ｍＬ（１ｏ：Ｏ．２），　罗红霉素９．９９０ｘ１０　ｇｇ／ｍＬ（１０：Ｏ．１　，头孢拉定　１．９９９ｘ１０一　ｇｇ／ｍＬ（１０：０．２），乙酰螺旋霉素４．９９５ｘ　６４　５２＊　０　Ｏ　４６　５５　６０　７８＊　２８　５６＊　６ｌ　３７　Ｏ　Ｏ　表示有少量杂菌　２．２不同抗菌素对青枯菌无抑制作用的最佳浓度　配比　分组预测试验中通过直观分析法得出７种抗菌　素的最佳配比为：氧氟沙星４．９９５ｘ１０　￣ｇ／ｍＬ（５　Ｌ），氨苄西林１．９９９￣１０－４￣ｇ／ｍＬ（２００　，罗红霉素　９．９９２￣１０　￣ｇ／ｍＬ００　），阿奇霉素２．９９９ｘ１０　￣ｇ／ｍＬ（３　Ｌ），头孢拉定１．９９９ｘ１０１￣ｍＬ（２００　ｇＬ），　乙酰螺旋霉素６．９９３￣１　０一￣ｇ／ｍＬ（７０　Ｌ），克拉霉素　４．９９８ｘ　１０　￣ｇ／ｍＬ（５０　ｇＬ）．根据以上浓度做７因素３　水平试验，选取　ｌ８（３　）正交表（表３）．　从表３中极差　值可知，药剂Ｂ和Ｃ的　值最　大，即Ｂ和Ｃ对测定结果影响较大，且Ｂ和Ｃ中　ｋ３＞ｋ２＞ｋｌ，说明３水平的回收率最好，Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、　Ｇ药剂对试验有影响但不显著，根据七值可知回收率　较好的条件为，３水平Ａ，３水平Ｄ，３水平Ｅ，２水平　Ｆ，２水平Ｇ．对试验结果进一步正交试验方差分析，　结果表明，　和　均大于　界值，说明Ｂ、Ｃ对　测定结果影响显著，而　、　、　、　、ＦＧ都小　于　临界值，说明它们对测定结果影响不显著，与　极差分析的结果正好相符．综上所述，选择　Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３　Ｅ３Ｆ２Ｇ２为本试验的最佳条件，即氨苄西　林１００　ｇＬ（９．９９６￣１０～￣ｇ／ｍＬ），氧氟沙星１　（９．９９ｘ　１０＿。￣ｇ／ｍＬ），罗红霉素３　ｇＬ（２．９９８ｘ１０一￣ｇ／ｒｎＬ），头　孢拉定３　（３．０００￣１　０一，ｅ，／ｍＬ），乙酰螺旋霉素２０　锯　第３６卷第２期　杜桂萍等烟草青枯病菌的田间快速检测　１９５　２．３土壤中青枯菌的检测结果　菌性杂菌．随着菌量的增加，病情指数也在增加，　土壤含菌量与青枯菌发病情况基本呈正相关，可以　从表４可知：湘西土样中含菌量最多，永州　通过简单的线性回归得方￣ｙ＝２３．９２ｘ一１．５４（），为病　次之，郴州相对较少；加菌肥土样中菌量少于未加　情指数，　为平皿所测土样中菌量）．　菌肥土样中菌量，检测平板中未长出真菌和其他细　表４土样中所含菌量与病情指数　３讨论　Ｔａｂｌｅ　４　Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ　采用平板菌落计数法，在肉汁冻培养基中加人　不同浓度抗菌素药剂，以方差分析优化试验条件，　得出能抑制真菌和绝大多数细菌而不抑制青枯菌　生长的选择培养基，能够快速检测出土壤中青枯菌　的菌量，可提前预测青枯病的发病情况，及时采取　措施预防青枯病．此方法不需要高端仪器，简便易　（下转第２０２页）　２０２　湖南农业大学学报（自然科学版）　２０１０年４月　（上接第１９５页）　行．试验结果表明这种选择培养基对检测土壤中青　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　枯菌有较好效果，且与青枯病发病程度呈正相关．　Ａｃａｄｅｍｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０００，４１：１２１—１２８．　今后可进一步系统检测土壤青枯菌，提出确实有效　［７］Ｐｒｉｏｕ　Ｓ，Ｇｕｔａｒｒａ　Ｌ，Ａｌｅｙ　Ｐ．Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ　ｆｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａ－　的施用生防菌的时期．　ｃｅａｒｕｍ（ｂｉｏｖａｒｓ　１　ａｎｄ　２Ａ１　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｕｓｉｎｇ　ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ　［Ｊ】．Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００６，５５（１）：１－１０．　参考文献：　［８】王胜坤，王军，徐大平．植物青枯菌检测方法研究进　展【Ｊ】＿南京林业大学学报：自然科学版，２００７，３ｌ（２）：　［１】番华彩，唐嘉义，秦小萍，等．烟草青枯病防治研究　Ｉ１８一Ｉ２２．　进展［Ｊ】．云南大学学报：自然科学版，２００８，３０（Ｓ１）：　［９】　Ｇｒａｎａｄａ　Ｇ　Ａ，Ｓｅｑｕｅｉｒａ　Ｌ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　３１．３５．　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　ｉｎ　ｓｏｉｌ，ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ａｎｄ　ｐｌｎａｔ　ｒｏｏｔｓ　［２】朱贤朝，王彦亭，王智法．中国烟草病害［Ｍ］．北京：　［Ｊ】．Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，２９：　中国农业出版社，２００２：１５２．１５３．　４３３—４４０．　【３】Ｗｅｎｎｅｋｅｒ　Ｍ，Ｖｅｒｄｅｌ　Ｍ　Ｓ　Ｗ，Ｇｒｏｅｎｅｖｅｌｄ　Ｒ　Ｍ　Ｗ，ｅｔ　［１Ｏ］张新生，罗宽．番茄青枯病检测土的初步研究【Ｊ】．湖　ａ１．Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（Ｐｓｅｕｄｏ—ｍｏｎａｓ）ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　ｒａｃｅ３　南农业大学学报（原湖南农学院学报），１９８８，１４（４）：　（ｂｉｏｖａｒ２）ｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｎａｔｕｒａｌ　ｗｅｅｄ　ｈｏｓ￣：Ｆｉｒｓｔ　４７．５Ｏ．　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｎ　ｓｔｉｎｇｉｎｇ　ｎｅｆｉｆｅ（Ｕｒｔｉｃａ　ｄｉｏｉｃａ）［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ　［１　１】方中达．植病研究方法［Ｍ】．３版．北京：中国农业出　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏ－ｌｏｇｙ，１９９９，１０５：３０７—３１５．　版社，１９９８：１８２．１８３．　［４】易有金，尹华群，罗宽，等．烟草内生短芽孢杆菌的　［１２】王莹，辛士刚．正交试验在ＩＣＰ２ＡＥＳ法测定野菜中的　分离鉴定及对烟草青枯病的防效［Ｊ］．植物病理学报，　微量元素中的应用［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００４，　２００７，３７（３）：３０１－３０６．　１０（２４）：１２５３—１２５６．　［５】彭细桥，刘红艳，罗宽，等．烟草内生青枯病拮抗细　菌的筛选和初步鉴定［Ｊ］．中国烟草科学，２００７，２８（２）：　３８—４Ｏ．　责任编辑：罗慧敏　【６］Ｌｅｅ　Ｙｕｎｇ－Ａｎ，Ｗａｎｇ　Ｃｈｉ—Ｃｈａｎｇ．Ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　英文编辑：胡东平　ｔｌ１ｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｓａｍｐｌｅｓ