荧光光度法测定维生素B2的含量

实验五 荧光光度法测定维生素B2的含量

一、实验目的

1、学习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理； 2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定维生素B2的方法。

二、实验原理

1.荧光光度法原理

（1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：

IF2.303I0bc

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：

IFKc

这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 （2）荧光分析法的特点：

a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。

b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。 （3）荧光光谱

激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。

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发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。

固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。 （4）荧光分析仪器

常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：

2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量

维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：

光源 I0 单色器 液槽 If 单色器 I I0 显示器 检测器 - - 总结资料

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OHHOHOHOHH3CNHHHHNONHH3CNCO

维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。

多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。

维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

三、试剂与仪器

仪器：970CRT荧光光度计，5 ml吸量管1只，2 ml吸量管1只， 50 ml容量瓶6只, 100 ml容量瓶1只，

试剂：10.0μg/ml（实际浓度请自己记录）维生素B2标准溶液，冰乙酸，试样若干

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四、实验步骤

970CRT荧光光度计的基本操作

1. 先打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机电源，荧光光度计工作站自动启动并初始化仪器，预热20—30min

2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数例如：设置激发波长为440nm，发射波长为330 nm，灵敏度＝2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。 3. 样品测定

(1)标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：

在6个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 (2)未知试样的测定:

准确称取一片维生素B2片,用研钵研细，加少量水溶解后（不得超过定容体积），将其全部转入50 ml比色管中，于超声振荡器中超声溶解后，定容。 将超声分解后的样品试液经0.45μm膜过滤后,准确取滤液适量置于50 ml比色管中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。

（黑体字部分实验报告中请按自己实际操作撰写）

4.定性实验：改变狭缝宽度、灵敏度、扫描速度，记录发射光谱曲线，进行实验条件的讨论。

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5. 退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。

五、实验结果及数据处理

1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线

2．根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。

六、思考题

1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因?

2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 3. 如何绘制激发光谱和荧光发射光谱?

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五．实验结果及数据处理

1用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 表一 CB2/µg/ml INT 0.186 45.255 0.372 88.435 0.558 132.581 0.744 178.361 0.930 215.736 1.116 269.552

图一

2.根据待测液的荧光强度从标准工作曲线上求得其浓度计算出试样中含量 样品荧光强度 表二

mB2=0.0681g

类别 组别 A B C 总体平均值 233.8836667 1 234.354 233.541 232.405 2 234.357 234.411 233.794 3 234.359 233.557 234.175 平均值 234.3567 233.8363 233.458

根据表二INT总体平均值=233.8836667，由图一标准曲线得CB2=0.9825µg/ml

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CB25010010-6VB2含量100%7.2%

mVB2片3.定性分析实验结论

灵敏度越大，峰越高，峰越宽；

扫描速度改变，峰高不变，峰宽不变； EX缝宽变小，峰高变大，峰变宽； EM缝宽变大，峰变高，峰变宽。 六．思考题。

1.试解释荧光光度法较吸光光度法灵敏度的原因。

答:荧光光度与激发光强度成正比，提高激发光强度可成倍提高荧光强度，同时提高仪器的灵敏度，，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸光光度法无论是提高激发光强度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，吸光光度法的灵敏度不变，因此荧光光度法较系光棍光度法灵敏度高。

2.维生素B2在PH=6-7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？

答：维生素B2在碱性溶液中景光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 3.如何绘制激发光谱和荧光发射光谱？

答：激发光谱：固定测量波长（选取最大发射波长）化合物发射的荧光强度与照射波长的关系曲线，激发光谱曲线最高处处于激发状态的分子最多，荧光强度最大。

发射光谱：固定激发波长（选取最大激发波长）化合物发射的荧光强度和发射光波长关系曲线。

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