酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算

酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算(以日 立

U3010为例)

强玮 2014-3-31

一、Km

根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程 (Michaelis-Menten equation ):

V =(VmaxS)/(Km + S) 当v=0.5Vmax

时，Km=[S]，可见Km等于酶促 反应的初速率为最大速率 Vmax —半时的底物 浓度。Km值一般在10

6

-2

-

~10mol/L之间，单位 一般为mM或者uM。Km只与

由于Km值与酶的浓度无关，所以计算时无 需

酶的性质有关， 而与酶的浓度无关。

对蛋白进行定量，理论上诱导破碎的菌体上清 (粗酶液)即可用来测酶活计算。具体计算方法 以前常用双

倒数法，但是这种算法现在稍微好一 点的SCI杂志都不认可了，相对来说现在更准确 和更常用的计算方法是直接对不同浓度的底物 测得的酶活数据用米氏方程(Michaelis-Menten equation V

=(VmaxS)/(Km + S))进行非线性回 归(nonlinear regression)，拟合的方程中就给出值。

了计算出的Km

非线性回归方法相对于双倒数法稍微麻烦 的地方在于测量酶活时底物浓度的选择要尽量 多，并且要覆盖米氏方程曲线的三个区域， 图为例，酶以下 反应速度遵循米氏方程的规律，先是 一级反应，速度随底物浓度上升也直线上升， 然 后是混合级反应，趋于平缓，最后进入零级反应， 反应速度不再随浓度上升而上升，而是趋于一个 稳定的值。根据这个规律，具体梯度测试时，底 物浓度的选点很重要，要根据实时测得的斜率或 活度值实时调整，尽量要覆盖这三个区域，这样 回归拟合出来的米氏方程才是准确的， 计算出的 酶动力参数才是正确的

初速度

Hill Fit of初速度

0.3・

0.° ---------------------- ---------------- 1 --------------- ---------------- 1

0 2° 4°

底物浓度（mM）

比

度 速 初

0.1 - 0.2・

用于非线性回归分析的软件很多， Origin

8.0我比较喜欢，将酶活数据输入后，全选，

“ Analysis \"菜单下选择\"Fitting ”,进一步选择 “ Nonlinear curve fit \"进入对话框，在函数归

类

框“ Category ”中选址“ Growth/Sigmoidal ”类 函数，接着在子函数框“ Function ”中选择“ Hill

函数。由于Origin 8.0中没有保存米氏函数，但 是Hill函数与米氏函数类似（如下）（“Origin

Basic Functions ”函数下的Hyperbl也是类似与

米氏函数的可选函数），当n=1是就完全变成了 米氏函数，所以接着在左边的\"Parameters \"中 将n=1的可选框构上，点击\"Fit \"进行拟合，

Km、Vmax值等拟合的数据就在弹出的窗口中

显示出来了，注意这里的Vmax值不是本文所指 的

Vmax值，两者的意义和单位都不一样，发表

用的Vmax单位通常为 nkat Xmg-1 protein （见 下文），而此处的Vmax为输入数据时的Y轴值, 如果数据由日立U3010分光光度计测得，则其 代表“活度\"， 即每分钟内吸光度变化的量

X

：、Vmax

n

Hill 函数： Y=Vmax K+

n

Vmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即 酶完

全被底物饱和时的反应速度，与酶浓 度呈正比。通常发表论文的Vmax单位为

nkat >mg protein，表示每毫克纯化的蛋白有多 少个nkat活力。这里有必要弄清楚酶活力单位 的意义，国际上有两种活力单位：IU和Kat, 它们的意义分别为：

-1

1IU :指在特定条件（25C，其它为最适条 件）

下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量， 或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

1Kat :在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底 物

转化的酶量。

Kat 和 IU 的换算关系：1 Kat=6 x 10IU，

7

1IU=16.67n Kat

日立U3010测得的酶活力是用“活度”表 示的，即每分钟内吸光度变化的量。所以要将活 度换算为Kat，首先必须将吸光度的变化与底物 的变化联系起来。这里的底物是指具有特定波长 的光吸收，用来指示酶反应进程的物种，如氧化 还原酶通常选择NADH/NADPH。这里以托品酮 还原酶TRI为例，测定340nm处NADPH的活 度值。首先吸光度

Abs与底物浓度c是有公式联 系的：

Abs=c •£• l

在实际测定中，“「l”部分可以作为一个常 数处理，在一个反应体系中将NADPH的浓度固 定，测出吸光度A值后即可换算出“「1”值， 通常选3个

浓度，取三个“「1”的品均值。如 TRI的酶活测定中：

200 uM ・

£・ I=0.00671

£ ・ 1=1.342 £・ 1=0.00721

-

100 uM ・£・ 1=0.721 - 平

均 £・ I=0.00696

由于活度的意义是 1min内吸光度的变化 量，则选取一个线性比较好的酶反应的动态吸光 度曲线，记录下它0s和60s两个点的吸光度值， 用上面得到的£• I值算出各自的底物浓度，其 差值对应的就是该活度下的底物变化量。

如一反应：

活度

=0.1182/min

0s Abs=1.221 f c(NADPH)=175.4 uM 60s Abs=1.103 f c(NADPH)=158.5 uM

由于反应体系是1ml,则变化量为 △

c(NADPH)=175.4-158.5=17 nM , 所 以活度 0.1182/min对应17 nM的NADPH变化量，即每 分

钟，0.1182个活度表示有17 nM的NADPK发 生了转化。为便于计算，换算为：

0.1 活度 /min =14.38 n M/min (NADPH)

这样，吸光度的变化与底物的变化联系起来 就

联系起来了，用酶活力单位IU的定义来换算， 很容易就得出：0.1活度/min =0.01438 IU=0.24 n Kat

将上面非线性回归得到的 Vmax （活度）值 按上面的公式换算就得到了 nKat值，进一步除 以每管反应蛋白的量（mg）,就得出了标准Vmax （nkat Xng protein ） 的值。

-1

以木本曼陀罗TRI 3号重组蛋白为例，其对 托品酮酶活拟合的结果是 Km=2.65mM ,

Vmax=0.48879/min（活度），每管反应酶量为 13.285ug,则其

Vmax=4.8879 >0.24/0.013285=88.3 nkat mg^<

-

protein

三、Kcat

Kcat是酶的催化常数，定义为在单位时间内 每一

活性中心或每分子酶所能转换的底物 分子数，表示酶催化特定底物的能力。其单位一 般是S，即每秒

-1

钟内一个酶分子或酶活性中心能 催化多少个底物发生反应。

还是以托品酮还原酶

TRI催化托品酮和

NADPH的为例，其反应方程式如下：

托品酮 + NADPH - 托品+ NADP

物的转化量度关系上式0.1活度/min =14.38

nM/min (NADPH)已经提供了，我们只需 对反应中的

蛋白定量就行了。

还是以上面的例子计算，非线性回归拟合出 的

Vmax=0.48879/min(活度)，对应的底物 (NADPH )

转 化 量 是 △ c(NADPH)=4.8879 X14.38=70.29

nM/min。每管 反应酶量为13.285ug,重组酶蛋白的

分子质量为 33245.88道尔顿(这里的重组酶分子质量一定要 加上前面融合的标签序列，这里是 His标签)， 则酶分子数为 13285/33245.88=0.40nM,每秒钟 每个酶分子催化的底物分子数即

Kcat=70.29/(0.40 60)=2.93 s。

-1

注意：上面的计算默认了每个酶分子都作为 一个活性中心参与了催化反应，而没有顾及其是 否以二聚体或多聚体的形式。事实上，有些酶是 只以多聚体形式才有活性的，这时就要准确弄清 楚是几聚体，然后将相应的 Kcat值除以该值才 是准确的。 四、Kcat/ Km

Kcat/Km用来衡量酶的催化效率。这一表示 式

又被称为特异性常数，其包含了催化反应中所 有步骤的反应常数。由于特异性常数同时反映了 酶对底物的亲和力和催化能力，因此可以用于比 较不同酶

对于特定底物的 催化效率或同一种酶

对于不同底物的催化效率。其算法很简单，用 Kcat值除以Km值即可，单位一般为s>M或 s XmM，注

-1

-1

-1

-1

意两者是1000倍的关系，如上例， 其

Kcat/Km=2.93/3.65=1.11

s-1

xmM-1

=1110^1

>M-1

o