食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立

摘要建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR 快速检测方法。选取hlyA 基因作为靶序列设计1对引物,在单核细胞增生李斯特氏菌中能扩增出356 bp 的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为46个细菌。用该方法对36 份食品样品进行检测,检测结果与分离鉴定方法完全相符,表明该方法可适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。

关键词食品;单核细胞增生李斯特氏菌;PCR快速检测方法

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes,简称L.M,单增李氏菌),是一种人畜共患病病原菌[1],使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。该菌可通过眼睛及破损的皮肤、粘膜进入体内而造成感染,孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也会引起感染。单增李斯特氏菌不易被冻融,能耐受较高的渗透压,在土壤、地表水、污水、植物、青贮饲养中均有该菌存在,所以动物很容易食入该菌,并通过口腔—粪便的途径进行传播。据报道,健康人粪便中单增李斯特氏菌的携带率0.6%~16.0%,有70%的人可短期带菌,4.0%~8.0%的水产品、5.0%~10.0%的奶及其产品、30.0%以上的肉制品及15.0%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酷、未充分加热的鸡肉、鲜牛奶、冻猪舌等而感染,约占85%~90%的病例是由被污染的食品引起的。近年来,国外报道该菌所致的食物中毒越来越多,病死率高达30%～70%[2-3]。国内也不断有散发病例,引起了国内医学界的普遍关注。WHO在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一[4-5]。该菌在自然界分布广泛,以家畜、家禽兽为主要宿主,易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发[6-7]。

食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主要传播途径,由于该菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌,肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源[8]。随着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多,食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越突出,因此,在食品卫生微生物检验中必须加以重视。单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活,热处理已杀灭了竞争性菌群,使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活,则在食品加工中,中心温度必须达到70 ℃持续2 min以上。单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在,即使产品已经过热加工处理充分杀灭了李斯特氏菌,但有可能造成产品的二次污染。因此,蒸煮后防治二次污染是极为重要的。目前,国内流行的对单增李氏菌的检测方法为传统培养法,主要是按照国家标准GB4789.30-2010,该方法检测周期冗长,准备工作繁琐,耗时耗力。因此,该试验针对这一状况,拟在建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法,并将这一检测方法应用于食品样品的检测,检测结果与传统方法完全相符。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种。单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌种均购自山东省疾病预防控制中心,接种到营养肉汤中制成标准菌液,36 ℃增菌培养。

1.1.2检测样品。从济南市各超市及农贸市场购齐36份食品样品,分别为生猪肉、生鸡肉、袋装新鲜牛奶、烤肠、酱肉等几类。将这些样品分别用新建PCR方法和传统培养法进行检测,并对检测结果进行比较。

1.1.3核酸DNA制备。细菌基因组的提取使用的是天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒,操作步骤按照提取试剂盒说明进行。

1.2主要试剂及溶液的配置

PCR 反应试剂盒为大连宝生物工程有限公司生产的TaKaRa产品,细菌培养用显色培养基为法国科玛嘉(郑州博赛生物技术研究所)产品,增菌培养基为北京陆桥生物技术有限公司生产。

1.3主要仪器设备

Basic Panoramic 型均质器(西班牙IUL),DeltaDilutor型精密电子稀释器(西班牙IUL),S1000TM Thermal Cycler PCR 反应仪(美国BioRad 公司),DYCZ-20A型DNA序列分析电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.4试验方法

1.4.1PCR引物的设计与合成。从GenBank中获取各种不同来源地LM 的-hlyA基因序列,应用PrimerExpress软件分析基因序列,根据引物设计原则,在这些序列的保守区域筛选到能扩增目标片段长度为329 bp的1对引物,委托北京博尚生物有限公司合成,其序列如下:上游引物为5’-TGTC TCAGGTGATGTAGA-3’;下游引物为5’-TCGTTACCTTCAG GATCA-3’。

1.4.2PCR反应体系与条件。进行PCR扩增PCR反应体系为:模板DNA 1.0 μL、10 μmoL/L上下游引物各0.5 μL、2 mmoL/L dNTP 2.0 μL、2.5 U/μL Taq酶0.2 μL、25 mmoL/L Mg2+ 2.0 μL、10倍缓冲液2.0 μL、补DEPC水至25 μL。循环参数为:预变性95 ℃,5 min;变性95 ℃,50 s;退火56 ℃,50 s;延长72 ℃,30 s;30个循环;再延长72 ℃,10 min。产物鉴定:扩增产物于1.5% 琼脂糖凝胶上电泳,经EB染色后,紫外灯下观察。

2结果与分析

2.1新建PCR检测方法的特异性

设计的PCR反应应具有能从复杂样品中特异性地扩增目标片段的能力,因此选择合适的用于扩增检测的基因是保证检测方法特异性的关键。试验选择了单增李氏菌的hlyA基因,扩增片段为356 bp,具有良好的种特异性。将单增李氏菌标准菌株及金黄色葡萄球菌等4 种相关细菌进行检测,电泳图谱如图1所示。新建方法除单增李氏菌出现明显条带外,其他菌株均不见扩增条带。表明该试验建立的PCR检测方法对单增李氏菌具有很好的特异性,与其他相关肠道细菌无交叉反应。

2.2新建PCR检测方法的灵敏性

以无菌操作将单增李氏菌标准菌种的纯培养液充分混匀,按10 倍递增稀释至10-1～10-8 浓度,然后分别取10-3～10-8各不同梯度稀释液提取核酸DNA,按新建PCR方法进行单增李氏菌检测,电泳结果如图2所示。从图2可以看出,最低可以检测的菌液的稀释数量级是107倍。另外,分别将10-5～10-8这4个浓度的纯培养液各取0.1mL,划线接种单增李氏菌科马嘉选择性平板,培养后计数菌落数目。通过计算可知单增李氏菌标准菌种纯培养液中细菌浓度为4.6×108 cfu/mL。由此可知,纯培养的检测极限为46个细菌浓度。

2.3食品中单增李氏菌PCR检测方法的建立

将市面上购买来的36种样品,经单增李氏菌增菌液增菌培养后,选择3种样品人工感染单增李氏菌,检测过程分别采用新建PCR方法和传统培养法进行平行试验,将2种检测方法进行比较,进而评价该新建PCR 方法。试验结果表明,对于已知感染单增李氏菌的样品,2种检测方法均检测为阳性,对剩余33种样品,新建PCR方法检测有1份为单增李氏菌阳性,传统培养法也检出该样品为单增李氏菌阳性。2种检测方法检测阳性样品结果完全一致,符合率为100%。该试验过程利用传统培养法检测对新建PCR方法进行鉴定,通过对实际样品的检测,表明该方法对于单增李氏菌阳性样品未存在漏检,同时对于阴性样品也未出现假阳性结果,说明该新建PCR方法检测特异性较高。

3结论与讨论

单增李氏菌是是一种人畜共患病病原菌,使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。因此,为有效地预防和控制食品传播疾病,建立快速、敏感及特异地检测食品中单增李氏菌的方法非常必要。传统培养法对单增李氏菌的检测,需经过增菌培养后再进行分离培养,然后将分离培养后的菌落进行多种生化试验、溶血试验、动物试验及动力试验等多步表型检测方法,过程繁琐、费时费力。因此,传统培养法在快速、敏感与特异性等方面具有自身的局限性。

该试验过程利用新建PCR方法对实际样品进行检测,通过与传统培养法检测

结果进行比较,该新建PCR方法对已知被单增李氏菌污染的样品都能检测出来,对未知污染状况的样品进行检测,发现有1 个样品被单增李氏菌污染,表明该方法对于单增李氏菌阳性样品未存在漏检;同时对于阴性样品也未出现假阳性结果,说明该新建PCR方法检测特异性较高,适用于食品中单增李氏菌的检测,灵敏度高,结果准确。

4参考文献

[1] NAKAMA A,MATSUDA M,ITOH T,et al.Molecular typing of listeria monocytogenes isolated in Japan by pulsed-field gelelectrophoresis[J].J Vet Med Sci,1998,60(6):749-752.

[2] KERR K G,LAOEY-LISTERIOSIS R W.New problems with an old pathogen[J]. J of Hospital Infention,1988(12):247.

[3] 沈晓盛,郑国兴,李庆,等.食品中单核细胞增生李斯特菌的危害及其检测[J].食品与发酵工业 2004,30(8):87-91.

[4] RYSER T,ELMER H M.Listeriosis and food satiay[J].Marcel Dekkeinc,1991,6(2):214.

[5] 徐德顺,吴晓芳,程平庆.实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较[J].中国卫生检验杂志,2007,17(5):861-863.

[6] 寇运同,马洪明,刘晨光.用PCR技术快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特氏菌[J].食品科学,2001,22(5):52-55.

[7] 肖义泽,任丽娟.云南省首次动物源性李斯特氏菌病暴发的流行病学调查[J].中华流行病学杂志,2000,21(3):236.

[8] 袁宝民.食品微生物学及其检验[M].沈阳:东北大学出版社,1993:96.