(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103555848 A(43)申请公布日 2014.02.05
(21)申请号 201310553552.0(22)申请日 2013.11.08
(71)申请人复旦大学
地址200433 上海市杨浦区邯郸路220号(72)发明人于文强 肖敏 赵丽萍
(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公
司 31100
代理人陈静(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)
权利要求书1页 说明书14页权利要求书1页 说明书14页
序列表9页 附图4页序列表9页 附图4页
(54)发明名称
小RNA的3’-5’-qPCR定量检测技术(57)摘要
本发明涉及一种小RNA的3’-5’-qPCR定量检测技术，揭示了一种基于荧光定量PCR技术进行从内向外即3’→5’PCR，对小RNA进行高特异性、高灵敏度以及低成本检测和定量的方法。
CN 103555848 ACN 103555848 A
权 利 要 求 书
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1.一种检测待测样品中的特定小RNA的方法，其特征在于：所述方法包括：(1)从待测样品中提取总RNA；(2)以(1)的总RNA为模板，用小RNA特异逆转录引物进行逆转录反应，获得包含cDNA的逆转录产物；其中，所述的小RNA特异逆转录引物的5’端带有无关序列，3’端与小RNA的3’端互补；所述的无关序列与待测样品基因组中任何核酸序列不发生互补；
(3)以(2)的包含cDNA的逆转录产物为模板，以小RNA特异正向引物和特异反向引物进行3’→5’PCR反应，获得PCR产物；所述的小RNA特异正向引物的5’端带有无关序列，3’端与小RNA逆转录获得的cDNA的3’端互补；
(4)分析(3)的PCR产物，获得小RNA的存在情况及存在量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无关序列长度10-60bp；较佳地15-50bp；更佳地18-30bp；较佳地，所述的小RNA特异逆转录引物的5’端无关序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的小RNA特异正向引物的5’端的无关序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，调节所述的无关序列的GC含量，使小RNA特异逆转录引物或小RNA特异正向引物的Tm值保持在60±3℃左右，使引物适用于荧光定量PCR。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小RNA特异逆转录引物的3’端5-9个碱基与小RNA的3’端5-9个碱基互补。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小RNA特异正向引物的3’端5-18个碱基与小RNA逆转录获得的cDNA的3’端5-18个碱基互补。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当多个特定小RNA之间存在两个碱基以上的差异时，在一个系统中同时检测多个特定小RNA。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，小RNA特异逆转录引物与小RNA特异反向引物序列相同。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用3’末端存在错配时不能正确延伸的特点来区分小RNA的单碱基差异。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3’→5’PCR反应是3’→5’荧光定量PCR反应；较佳地，采用SYBR荧光染料进行荧光定量PCR。
10.一种检测待测样品中的特定小RNA的检测试剂盒，其特征在于，包含以下组分：(a)小RNA特异逆转录引物，其5’端带有无关序列，3’端与小RNA的3’端互补；(b)小RNA特异正向引物，其5’端带有无关序列，3’端与小RNA逆转录获得的cDNA的3’端互补；
(c)小RNA特异反向引物。
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说 明 书
小RNA的3’-5’-qPCR定量检测技术
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技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新的小RNA的3’-5’-qPCR
定量检测技术。
背景技术
[0002] 小RNA包括内源或外源导入的siRNA及内源性microRNA、piRNA等，它们不编码蛋白质且高度保守并广泛存在于各物种中。microRNA广泛存在于各个物种并具有组织特异性表达，长约21-25个核苷酸，由Dicer加工而成，主要功能是通过2-8核苷酸位置的种子序列与靶标不完全互补配对，在翻译水平抑制基因表达，一个microRNA可调控多个靶基因，可见microRNA参与多个信号通路的调控，在生理和各种病变过程中发挥作用。现在，大约50%已鉴定的人microRNA编码基因被发现位于与肿瘤相关的染色体易断裂区域，几乎所有恶性肿瘤中都有发现microRNA异常表达或者发生突变。[0003] 2006年7月，Nature、Science等杂志几乎同时报道了一类新的非编码小RNA——piRNA。piRNA大约24-30个核苷酸长，它与Argonaute家族成员piwi蛋白结合形成复合物。与microRNA不同，piRNA的形成不需要RNA酶Dicer的参与。它们存在于从果蝇到人的许多动物的雌雄生殖细胞中。很大一部分的piRNA与反转录转座子的序列有关，这说明piRNA可能参与这些可移动元件的沉默，从而维持生殖细胞基因组的完整。[0004] siRNA也是一种小分子RNA，长度与microRNA类似，也由Dicer加工而成，不同的是siRNA主要通过与靶标mRNA完全互补配对来降解mRNA从而抑制翻译。人们利用siRNA的生理功能，使之成为实验室中强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预(RNA interference，RNAi)，双链RNA经酶切后会形成很多小片段，即为siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。现在仍在不断涌现新的小RNA。[0005] 由于小RNA与其他编码蛋白的基因不同，所以它的检测和定量方法很难套用普通基因的检测模式。首先，由于小RNA非常短且没有poly(A)修饰，所以无法按照普通引物的设计要求去选择合适的位置设计合适Tm值的引物进行扩增反应；其次，小RNA比如microRNA的一些家族成员非常相似，往往只有一两个碱基的差别，所以小RNA的检测对特异性的要求也很高；此外，小RNA长度太短，不足以掺入足够的SYBR Green进行荧光定量检测；综合小RNA检测的各方面特点，它的有效检测与定量方法大致需要满足以下要求：(1)高特异性，能够区分单碱基差别的小RNA；(2)高敏感性，能够进行荧光定量PCR检测；(3)可用于定量分析各种类型小RNA的表达水平；(4)比较容易操作，不需要一些一般实验室很难具备的试剂和仪器；(5)低成本。
[0006]
到目前为止，已有的小RNA检测方法可以大致进行如下归类，基于小RNA捕获手段来分，可以分为基于杂交的检测技术、基于扩增的检测技术以及克隆检测。杂交主要指Northern blots、原位杂交、基因芯片，扩增方面主要指实时定量PCR和gold
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说 明 书
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nanoparticle-initiated silver enhancement，克隆方面主要是类似于miRAGE的方法。这些方法中，Northern blots和原位杂交属于低通量检测方法，实时定量PCR和miRAGE通量中等，芯片技术为高通量检测；并且荧光定量PCR和芯片技术属于定量方法，Northern blots和原位杂交属于半定量或者主要只用于检测有无的方法。事实上，这些方法并非完美，各有固有的优缺点，有的方法灵敏度和特异性不够，有的方法成本过高。[0007] 大量的小RNA检测技术不断被开发出来，比如各种变化多样的芯片，PCR技术，套索(padlock)和滚环复制方法，基于ELISA的分析技术，单分子检测技术，基于SAGE的miRAGE技术，基于RNA引物的Klenow酶(RAKE)分析。第一个microRNA的发现就是通过Northern blots，到目前为止Northern blots仍然是小RNA检测的黄金标准。但是Northern blots仍然具有劣势，比如Northern blots使用同位素标记使检测非常敏感，但整个实验非常费时。而且Northern blots不利于进行大批量样本以及多种小RNA的同时检测。如果不使用昂贵的锁核苷酸探针，Northern blots实验起始总RNA量约需要5-25μg。到目前为止，从已发表文章使用方法统计来看，使用最为广泛的小RNA检测和定量方法主要就是芯片技术和实时定量PCR技术。在众多的小RNA检测方法中，芯片技术可以说是近乎完美的用于获得小RNA表达谱的方法，因为其他的方法有一个共同的缺陷就是没法进行高通量全基因组分析。但芯片技术也有它固有的缺陷，首先芯片技术很难毫无偏倚的放大小RNA表达量信号，也就是说它的灵敏度不高；其次，芯片基于公司的研发，整个过程是需要时间的，而定制芯片的成本又非常高，所以芯片的方法不能用于新的小RNA以及其突变体的发现以及这些小RNA的检测和定量。[0008] 所以，实时定量PCR虽没有芯片那么高通量，但是确实是实验室最通用、最实用的检测与定量方法。许多同时进行扩增和定量小RNA的qRT-PCR(quantitative real-time PCR)方法被推出，使用较多的是三种方法：1.Invitrogen公司Poly(A)加尾法：先在microRNA 3’端加上ploy(A)，再用带有adapter poly(T)引物作为逆转录引物获得first strand cDNA，接着使用对应adapter设计的通用正向引物以及microRNA特异反向引物进行PCR反应。此方法成本较低，使用SYBR Green染料即可，但仅由PCR步骤中的单条microRNA特异引物决定整个检测方法的特异性，显然不适用于相似度高的小RNA检测。[0010] 2.ABI公司茎环法：采用带有茎环结构的microRNA特异引物进行逆转录反应获得first strand cDNA，同时由茎环结构引入adapter，接着利用对应adapter的通用正向引物、microRNA的特异反向引物并结合taqman探针进行PCR反应已经荧光定量检测。此方法较Poly(A)加尾法检测特异性有所提高，但是茎环引物设计方法复杂，Taqman探针成本颇高。
[0011] 3.Exiqon公司锁核苷酸系统：用带有adapter的microRNA特异性逆转录引物获得first strand cDNA，接着用对应adapter的通用正向引物以及带有锁核苷酸修饰的microRNA特异反向引物进行PCR反应。其中锁核苷酸修饰可以增加特异引物模版结合的稳定性，提高引物Tm值。此方法在特异性方面有所改进，也没有茎环结构设计的难度大，但是
这也是上锁核苷酸修饰成本高，并且可检测的小RNA范围局限于公司能够提供的引物库，
面两个方法共同的问题。[0012] 总的来说，上述方法的基本思路第一步一般都是延伸使小RNA被延长以适合进行
[0009]
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荧光定量反应，主要的延伸方法有使用颈环结构的引物或者带Oligo dT的引物，这些方法要么灵敏度不够，要么需要使用taqman探针或者锁核苷酸修饰，并且引物需要多次尝试和检验才能找到最佳的引物以及反应条件，昂贵的探针或者修饰和费时的引物条件摸索使这些方法多数商业化了，并且公司研发的速度有限，很难让大家及时购买到新近发现的小RNA检测试剂盒，更不可能通过购买产品去快速检测自己发现的小RNA了。发明内容
本发明的目的在于提供一种新的小RNA的3’-5’-qPCR定量检测技术。[0014] 在本发明的第一方面，提供一种检测待测样品中的特定小RNA的方法，所述方法包括：
[0015] (1)从待测样品中提取总RNA(含小RNA)；[0016] (2)以(1)的总RNA为模板，用小RNA特异逆转录引物进行逆转录反应，获得包含cDNA的逆转录产物；其中，所述的小RNA特异逆转录引物的5’端带有无关序列，3’端与小RNA的3’端互补；所述的无关序列与待测样品基因组中任何核酸序列不发生互补；[0017] (3)以(2)的包含cDNA的逆转录产物为模板，以小RNA特异正向引物(对应于小RNA的5’端或cDNA的3’端)和特异反向引物(对应于小RNA的3’端)进行3’→5’PCR反应，获得PCR产物；所述的小RNA特异正向引物的5’端带有无关序列，3’端与小RNA逆转录获得的cDNA的3’端互补；所述的小RNA特异反向引物其可以是小RNA特异逆转录引物，或是针对待测小RNA特异性设计的引物；[0018] (4)分析(3)的PCR产物，获得小RNA的存在情况及存在量。[0019] 在一个优选例中，所述的小RNA特异反向引物可以是小RNA特异逆转录引物。[0020] 在另一优选例中，所述的无关序列长度10-60bp；较佳地15-50bp；更佳地18-30bp；较佳地，所述的小RNA特异逆转录引物的5’端无关序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的小RNA特异正向引物的5’端的无关序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0021] 在另一优选例中，调节所述的无关序列的GC含量，使小RNA特异逆转录引物或小RNA特异正向引物的Tm值保持在60±3℃(较佳地60±2℃)左右，使引物适用于荧光定量PCR。
[0022] 在另一优选例中，所述的小RNA特异逆转录引物的3’端5-9个(较佳地6-8个)碱基与小RNA的3’端5-9个(较佳地6-8个)碱基互补。[0023] 在另一优选例中，所述的小RNA特异正向引物的3’端5-18个碱基(较佳地6-16个)与小RNA逆转录获得的cDNA的3’端5-18个碱基(较佳地6-16个)互补。[0024] 在另一优选例中，所述的待测样品可以是动物、植物、病毒等任何存在小RNA的生物；从样本类型来看，所述的待测样品可以是全血、血清、血浆、唾液、尿液、组织液原液、细胞培养基等。
[0025] 在另一优选例中，所述的小RNA包括10-50bp(或nt)的小RNA。[0026] 在另一优选例中，所述的待测样品也可包含提纯的短的DNA(如10-50bp或者nt的小DNA)。
[0027] 在另一优选例中，所述的无关序列起到信号放大的作用。
[0013]
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在另一优选例中，当多个特定小RNA之间存在两个碱基以上的差异时，在一个系
统中同时检测多个特定小RNA。[0029] 在另一优选例中，小RNA特异逆转录引物与小RNA特异反向引物序列相同。[0030] 在另一优选例中，利用3’末端存在错配时不能正确延伸的特点来区分小RNA的单碱基差异。
在另一优选例中，所述的3’→5’PCR反应是3’→5’荧光定量PCR反应；较佳地，
采用SYBR荧光染料进行荧光定量PCR。[0032] 在本发明的另一方面，提供一种检测待测样品中的特定小RNA的检测试剂盒，包含以下组分：
[0033] (a)小RNA特异逆转录引物，其5’端带有无关序列，3’端与小RNA的3’端互补；[0034] (b)小RNA特异正向引物，其5’端带有无关序列，3’端与小RNA逆转录获得的cDNA的3’端互补；
[0035] (c)小RNA特异反向引物。[0036] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：逆转录反应试剂或荧光定量PCR检测试剂。
[0037] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
[0031]
附图说明
[0038] 图1、本发明原理示意图。[0039] 图2、Microarray检测三种转移潜能不同的细胞中microRNA的表达结果图。[0040] 图3、qPCR验证图2的microarray结果图。[0041] 图4、比较大鼠胎鼠脑组织与肾脏组织let-7家族的表达结果图。[0042] 图5、通过检测仅有单碱基差别的合成的microRNA mimics来验证方法的特异性。具体实施方式
[0043] 本发明人经过深入的研究，基于荧光定量PCR技术，提供了一种进行从内向外即3’→5’PCR对小RNA进行高特异性、高灵敏度以及低成本检测和定量的方法，以及在此基础上研发成的试剂盒。本发明可用于多种样本类型中各种小RNA的表达量分析及临床检测。原理示意图见说明书附图——图1。本发明所涉及的小RNA检测方法，包括：提取
总RNA(含小RNA)，用带有无关序列的小RNA特异逆转录引物在逆转录酶的催化作用下合成cDNA；然后，以带有无关序列的小RNA特异正向引物和特异反向引物进行从内到外，从3’→5’荧光定量PCR反应，从而检测小RNA的表达量。本发明的3’-5’-qPCR定量检测技术，每一步PCR反应，引物都是在模板的中间搭上，从3’到5’进行扩增，这样就使得反应非常的特异。
[0045] 应用本发明的方法，检测和定量结果特异性及准确性高，这是由于每一步PCR反应，引物都要进行特异性识别。同时，无关序列不仅仅是为了平衡GC，而且是为了增加荧光定量PCR的时候的荧光强度，从而运用低成本的、简单的SYBR Green就能够实现。[0046] 作为本发明的优选方式，所述的检测方法通过以下技术方案实现：
[0044]
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1.总RNA的提取
[0048] 可以采用本领域常用的方法和试剂盒来进行总RNA的提取。较佳地，所述的总RNA提取包括：A、样品处理；B、RNA分离；C、RNA沉淀；D、RNA洗涤；E、RNA溶解；F、RNA浓度测定；G、RNA电泳检测。[0049] 2.RNA的逆转录
[0050] 以包含无关序列的小RNA特异逆转录引物进行逆转录，如需同时检测多种小RNA，可以同时加入几种特异性的逆转录引物，从而扩增从相应小RNA的第一链cDNA，此步骤可使小RNA延长序列。延长的序列长度视无关序列的长度而定，作为本发明的优选方式，所述的无关序列长度10-60bp；较佳地15-50bp；更佳地18-30bp。所述的无关序列起到信号放大的作用。作为本发明的更优选方式，还通过调节所述的无关序列的GC含量，使小RNA特异逆转录引物或小RNA特异正向引物的Tm值保持在60±3℃(较佳地60±2℃)左右，使引物适用于荧光定量PCR。[0051] 3.荧光定量PCR检测
[0052] 以包含有无关序列的小RNA的特异正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR，检测样本中各种小RNA的含量。此步骤可以使小RNA进一步延长，从而有利于实施小RNA荧光定量PCR检测。此定量方法可以比较不同样本中相同小RNA的表达量水平；如需比较不同小RNA在相同样本的表达水平，则可以通过实验制作标准曲线获得不同小RNA引物的扩增效率，从而进行不同小RNA的表达量比较。
[0053] 逆转录阶段以及PCR阶段进行两次应用无关序列来延长microRNA扩增产物的长度，有利于进行小RNA的PCR鉴定以及荧光定量检测。两个阶段可以应用相同的无关序列或不同的无关序列；较佳地应用不同的无关序列。通过特异逆转录引物在逆转录步骤即提高检测的特异性。通过特异正向引物和特异反向引物在PCR步骤中的每一步提高检测的特异性。
[0054] 所述的PCR采用的是从外向里(3’→5’)延伸的方式，比传统从里向外的延伸方式特异性更高。
[0055] 作为本发明的优选方式，荧光定量PCR采用SYBR荧光染料，特异性地掺入DNA双链发射荧光信号，可不需使用昂贵的TaqMan荧光探针或者锁核苷酸技术，大大降低实验成本。
[0056] 基于本发明的新方法，本发明还涉及一种检测待测样品中的特定小RNA的检测试剂盒，包含以下组分：(a)小RNA特异逆转录引物，其5’端带有无关序列，3’端与小RNA的3’端互补；(b)小RNA特异正向引物，其5’端带有无关序列，3’端与小RNA逆转录获得的cDNA的3’端互补；(c)小RNA特异反向引物，其可以是小RNA特异逆转录引物，或是针对待测小RNA特异性设计的引物。较佳地，所述的试剂盒中还包括：所述的试剂盒中还包括：逆转录反应试剂或荧光定量PCR检测试剂；更佳地还包括说明应用上述试剂进行小RNA检测的使用说明书。
[0057] 所述的试剂盒应用于进行小RNA检测以及表达水平分析以用于基础研究和/或临床应用。
[0058] 本发明的主要优点在于：
[0059] 1.本发明的方法具有高度特异性，通过特异的逆转录引物、正向引物和反向引物
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从内向外进行PCR反应，可以区分两个甚至一个家族的高度同源的小RNA，甚至可以精确到区分单个碱基差异的小RNA；
[0060] 2.本发明的方法具有超高的定量线性范围和高度的检测灵敏度，检测的范围可以从几个拷贝到几万个拷贝；[0061] 3.样品消耗少，10pg-5μg的总RNA均适合实验的进行，如果是提取的小RNA，则需要的RNA量则更少；
[0062] 4.使用范围广，各种生物中提取的总RNA、细胞裂解物、细胞培养上清中的RNA都可作为样本用于小RNA的定量检测；[0063] 5.平台简单，价格实惠，整个检测过程所涉及到的试剂、耗材以及仪器均属于实验室常规配置，试剂、引物等价格均不昂贵。[0064] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。[0065] 实施例1、RNA的提取[0066] 1、RNA抽提
TM
[0067] (1)使用mirVana miRNA Isolation Kit抽提
[0068] 利用该试剂盒可以抽提总RNA(包括完整的小RNA)，也可以将小于200nt的小RNA单独抽提出来。总过程参照试剂盒配套protocol。[0069] (2)使用Trizol抽提RNA[0070] 常规的RNA抽提方法提取。[0071] 3、RNA检测
[0072] (1)抽完RNA后首先拿nanodrop检测RNA纯度。DNA、RNA的A260/A280、A260/A230比值均需在2.0左右为最好，同时记录好浓度。[0073] (2)跑胶鉴定RNA质量。使用RNA专用上样缓冲液跑胶，抽提较好的RNA可以看到明显的两条核糖体带。
[0074] (3)需反复使用的RNA建议分装冻于-80℃。[0075] 4、RNA除DNA
[0076] 为避免DNA的影响，需使用DNaseⅠ除去DNA。本发明使用Premega的试剂盒，并有自带Protocol，实验大致过程如下：
[0077] (1)溶于水或者TE的RNA 1–8μl
[0078] RQ1 RNase-Free DNase 10X Reaction Buffer 1μl[0079] RQ1 RNase-Free DNase 1u/μg RNA[0080] Nuclease-free水加至 10μl[0081] (2)配好后在37℃放置30min；
[0082] (3)加入1μl RQ1 DNase Stop Solution终止上面的反应；[0083] (4)65℃，10min使DNase失活。
[0084] 对于在总RNA中含量较少的小RNA，此步骤3、4替换成酚氯仿抽提，用10ul左右的RNase free的水稀释，可获得较浓缩的RNA，然后在后一步逆转录过程中，如果使用
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invitrogen的逆转录酶，可以进行最多5ug的RNA的逆转录。[0085] 实施例2、逆转录
[0086] 根据试剂盒(Invitrogen)配套protocol计算好自己要加入的RNA以及各种引物的体积。一般情况罗列如下：
[0087] (1)micro RNA特异性引物(GSP(特异反转录引物)) 0.2μl/小RNA[0088] 总RNA 10pg–5μg(一般200ng左右)[0089] RNAase Free Water 补水至13μl[0090] (2)65℃进行5min，立即放在冰上1min[0091] (3)5X First-Strand Buffer 4μl[0092] 0.1M DTT 1μl[0093] RNaseOUT 1μl
TM
[0094] SuperScript III RT 1μl[0095] (4)采用55℃进行逆转录70℃；[0096] (5)15min失活酶；
[0097] (6)cDNA最好稀释10倍以后再进行后续PCR反应。
针对micro RNA特异性引物，本发明进行了特殊设计，如果经过一次逆转录相同
时检测基因表达和特定的小RNA，可以在加入microRNA反转录引物的同时，再加上常规的random和oligod(T)引物进行反转录，这样的cDNA在后面的Q-PCR步骤中，则可以检测样品中小RNA的表达，同时能检测其他普通基因的表达。
[0099] 如果需同时在一管逆转录产物中检测2种或以上小RNA，并且这些小RNA的相似度不高，则可以在此步骤逆转录中，加入针对多个小RNA的特异性引物。[0100] 实施例3、PCR反应
[0101] 用小RNA对应的正向引物、反向引物进行PCR反应。其中反向引物可以与micro RNA特异性引物相同。但如果用于区别类似let-7家族那种，只有少数碱基差别的小RNA，则逆转录引物与PCR的反向引物也不同。通过各自不同的逆转录引物、正向引物、反向引物来达到区分少量碱基差别的小RNA。
[0102] 主要以sybrgreen qPCR操作为例，普通PCR操作类似qRNA。[0103] (1)在PCR管中混合下面试剂。对于多个反应，强烈建议减少移液误差。
[0098] [0104]
(2)离心确保所有成分在管子底部。[0106] (3)在预热的实时定量PCR仪上反应，步骤如下：[0107] PCR程序：
[0105]
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[0108]
(4)溶解曲线分析：参考仪器说明。
[0110] (5)收集数据，分析结果。[0111] 实施例4、应用实例1——分析骨肉瘤细胞中microRNA表达[0112] 骨肉瘤是青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，骨肉瘤容易发生肺转移，近几年对骨肉瘤肺转移的治疗一直没有有效的方法，即使是结合化疗疗法对肺转移灶的消除或控制作用也不显著。因此解决骨肉瘤肺转移的问题是骨肉瘤治疗的关键点，对骨肉瘤患者生存率的提高意义重大。[0113] 143B-GFP、MNNG-RFP和HOS TE85是三种遗传背景相同的常用人源性骨肉瘤
[0109]
移植细胞株，它们对应的ATCC名称与编号分别是143B(ATCCCl#5[R-1059-D](ATCC
[0114]
CRL-8303TM)，MNNG/HOS
CRL-1547TM)以及HOS(ATCCCRL-1543TM)。
HOS TE85是恶性程度比较低的一种骨肉瘤细胞，来源于人骨肉瘤组织，由JS Rhim建系产生；MNNG-RFP是用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(0.01mcg/ml MNNG)诱导HOS TE85所得到的恶性程度较高的骨肉瘤细胞，并且用病毒包装导入了RFP(红色荧光蛋白)，该细胞可以稳定表达红色荧光蛋白；144B-GFP是在HOS TE85细胞中导入了ki-ras基因，是恶性程度很高的一种骨肉瘤细胞，并且病毒包装导入了GFP(绿色荧光蛋白)，该细胞可以稳定表达绿色荧光蛋白。
[0115] 本发明人将143B-GFP、MNNG-RFP细胞培分别养后，分别用Trizol裂解约106细胞，并提取RNA，然后送给Exiqon公司采用如图2描述的miRCURYTMLNA Array(v.16.0)进行microRNA芯片检测，图2左侧小图展示了两种细胞之间差异表达microRNA的整体结果，图2右侧展示了一些经过分析后，得出的可信的、microRNA在143B-GFP、MNNG-RFP两种细胞表达差别超过2倍的microRNA。[0116] 接着，挑选芯片中差异表达的microRNA以及感兴趣的microRNA，进行Real-time PCR验证。
[0117] 逆转录方法以及试剂基本同前，用Q-PCR验证Microarray结果，看三种转移潜能不同的细胞中microRNA的表达。
[0118] [0119]
(1)hsa-miR-708-3p(miRBase：MIMAT0004927)的引物设计hsa-miR-708-3p的序列为：
(SEQ ID
NO:3)。
基于上述序列，进行引物设计。
[0121] 作为反转录引物，首先应该考虑其反转录效率，固在设计反转录引物时，与microRNA 3’端配对的序列不需要太长，一般6-8bp为最佳，对于hsa-miR-708-3p序列，后面6个碱基“UUCUAG”，U的含量稍高，于是反转录引物配对的个数，本发明人选取了7位，即与hsa-miR-708-3p后面7位碱基“CUUCUAG”互补配对，加上
[0120]
用于延长和调平的无关序列“TGTCAGGCAACCGTATTCACC”(SEQ ID NO:1)，设计的
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逆转录引物为“CTAGAAG”(SEQ ID NO:4)。鉴
于hsa-miR-708-3p没有其高度相似性的microRNA，在反向引物方面，可沿用其反转录引物作为反向引物。正向引物设计与microRNA对应的特异序列稍长，采用microRNA前15个碱基的部分“CAACUAGACUGUGAG”(SEQ ID NO:5)，再加上用于延长和调平的无关序列“CGTCAGCTGTCCGAGTAGAGG”(SEQ ID NO:2)，正向引物的序列为
(SEQ ID NO:6)。从而
进行real-time PCR反应。[0122] 综上，所设计的引物如下(RP为正向引物，RTP为反转录引物)：[0123] hsa-miR-708 3p
RP：
(SEQ ID NO:7)(其中虚
线下划线部分对应hsa-miR-708-3p序列5’端15个碱基，斜体部分为延长序列)；
[0124]
hsa-miR-708 3p RTP：CTAGAAG(SEQ ID NO:8)
(其中下划线部分与hsa-miR-708-3p序列3’端7个碱基配对，斜体部分为延长序列)。[0125] 反转录引物同时作为反向引物。
[0126] [0127] [0128]
(2)hsa-miR-1275(miRBase：MIMAT0005929)的引物设计hsa-miR-708-3p的序列为：
(SEQ ID NO:9)。
该microRNA只有17个碱基，但是本发明的方法并不受其长度的限制。进行引物
设计，设计方法类似hsa-miR-708-3p。最终引物为：
hsa-mir-1275RP：
(SEQ
[0129]
ID NO:10)(其中虚线下划线部分对应hsa-miR-708-3p序列5’端10个碱基，斜体部分为延长序列)；
[0130]
hsa-mir-1275RTP：GACAGCC(SEQ ID NO:11)
(其中下划线部分与hsa-miR-708-3p序列3’端7个碱基配对，斜体部分为延长序列)。[0131] 反转录引物同样作为反向引物。[0132] (3)其它microRNA引物设计[0133] 根据类似引物设计方法，本发明人还针对其它microRNA进行了引物设计，具体引物列表，见表1。[0134] 表1
[0135]
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[0136]
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表中，斜体部分为延长序列(无关序列)，虚线下划线部分对应microRNA序列5’
端，实线下划线部分与序列microRNA序列3’端碱基配对；RTP表示逆转录引物(反向引物)，RP为正向引物。
[0138] 由于hsa-let-7b，hsa-let-7g为两种相似的microRNA，故逆转录时，143B-GFP、MNNG-RFP和HOS TE85三个样品，均进行2管逆转录。即将需要检测的16种microRNA，分为2管进行逆转录，每管转8种microRNA。具体分法，首先hsa-let-7b，hsa-let-7g两种相似度高的microRNA必须分开逆转录，其他14种microRNA按顺序分开，前7种在一个系统中：hsa-miR-708 3pRTP、hsa-mir-1275RTP、hsa-miR-320a RTP、hsa-miR-378RTP、
hsa-miR-193a-3p RTP，与hsa-let-7b一起进hsa-miR-29a 5pRTP、hsa-miR-20a 5p RTP、
行逆转录。后7种在另一系统中：hsa-miR-101 3p RTP、hsa-miR-720RTP、hsa-miR-15a5p RTP、hsa-miR-3679-3p RTP、hsa-miR-3676RTP、hsa-miR-146b-5p RTP、hsa-mir-30c-2RTP，与hsa-let-7g一起进行逆转录。[0139] 结果如图3，图3中143B-GFP、MNNG-RFP中检测的microRNA表达结果与细胞的Microarray结果(图2)是相符的。[0140] 实施例5、应用实例1——比较大鼠胎鼠脑组织与肾脏组织let-7家族的MicroRNA表达
[0141] let-7家族中，人们最先发现的两个microRNAs(miRNAs)是lin-4和let-7，lin-4最初在线虫中被发现，并且控制干细胞分裂和分化的时间。作为第一个被发现的人类
[0137]
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miRNA，let-7紧随lin-4被发现，并且他的家族成员在序列和功能上是跨物种高度保守的，let-7的错误调控可以导致一些低分化的细胞状态及基于细胞的疾病的发生，例如癌症。人let-7家族有13位成员，位于9个不同的染色体位点，许多恶性肿瘤往往是失去了let-7家族的表达调控作用，因此，let-7家族被视为抑癌基因。因能调控细胞的终末期分化及凋亡，恢复let-7家族的表达在癌症的治疗中是有意义的。
Let-7家族调节从线虫到人的各种类生物的增殖和分化过程。成熟体(被称为
let7a到let7i)与let7a序列在少数位置有区别。同源体的表达水平不一样，其在器官发育和疾病起因上也不同。鉴别这些同源体将有助于阐明let7的功能。[0143] 本实施例中，进行let-7a、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7i的区分。它们在序列上较为接近，下图是let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、和let-7i与let-7a碱基的区别做了标识。
[0142] [0144]
当需要进行这种单碱基差别区分时，需要尽量利用仅有的碱基差异，使用不同的
逆转录引物、正向引物以及反向引物进行反应。
[0146] 如下图，对于rno-let-7a，将反转录引物设计在下划线位置
[0145]
UGAGGUAGUAGGUUG(SEQ ID NO:56)，可以与rno-let-7d、rno-let-7c区分，
正向引物设计到UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO:56)位置可以与rno-let-7e区
分，反向引物设计到UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO:56)位置，可以与rno-let-7f、rno-let-7i区分。
[0147]
rno-let-7c反转录引物设计在UGAGGUAGUAGGUUGU(SEQ ID NO:57)位
置可以与rno-let-7i区分，也能与rno-let-7a、rno-let-7d、rno-let-7e、rno-let-7f作为区分；正向引物设计在UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU(SEQ ID NO:57)可以与rno-let-7d作为明显区分，反向引物设计在UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU(SEQ ID NO:57)，可以与rno-let-7a做明显区分。其他几个设计原理类似。加的无关序列，用于延长和调平GC含量，与前面提到的序列一致。
[0148] 要区分这几种少数几个碱基差异的microRNA，逆转录需要分管进行。[0149] 本发明人提取大鼠胎鼠的肾脏以及脑组织，用trizol裂解，提取总RNA，进而进行逆转录。let-7家族的逆转录都分管进行，从而区分该家族的各个成员。[0150] 表2
[0151]
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表2中，第二列以下划线标示反向引物的设计位置，第三列与第四列分别以下划
线标示正向引物与反向引物的设计位置。如前方法根据表2标示位点来设计引物。[0153] 为了验证本发明的系统的特异性，本发明人分别合成了Rno-let-7c和Rno-let-7f miRNA的RNA序列，两者仅差2个碱基。应用Rno-let-7c引物分别进行Realtime PCR检测，结果发现在不同浓度的模板下扩增相差150-15000倍，说明本发明Real-Time PCR系统的特异性。表3表示了用不同浓度梯度的合成的两种microRNA进行引物扩增获得的结果。以1pM let-7c为模板，用let-7c引物扩增，real-time PCR CT值为23.4；而用1pM let-7f为模板，用let-7c引物扩增，real-time PCR CT值为30.7，相差7.3个CT值，相当于差154.3倍。当用10pM let-7c为模板，用let-7c引物扩增，real-time PCR CT值为19.4；而用10pM let-7f为模板，用let-7c引物扩增，real-time PCR CT值为30.3，相差10.9个CT值，相当于差1893.3倍。后面的情况类似。图5为该结果形成的柱状图。
[0154] 表3
[0152] [0155]
[0156] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独
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引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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