一株利用木糖产乙醇酵母菌的发酵条件的优化

Abstract: Response surface method was applied to optimize the fermentation conditions of a yeast strain that could ferment xylose to ethanol. The result showed that if inoculum solution was 15.00%, pH 6.0, anaerobic fermenting for 24 h at 30.0 ℃, the theoretical content of ethanol in medium could reach 1.447 g/L.

Key words: xylose; yeast; ethanol; response surface method

发展可再生能源,特别是生物能源是解决能源危机的重要手段,其中燃料乙醇由于其成熟的生产应用技术和丰富的原料来源成为世界各国首选的生物能源｡燃料乙醇的生产原料中,木质纤维原料因其最为丰富和廉价而引起了广泛的关注｡木质纤维原料中半纤维素约占20%~40%[1-3],85%~90%的半纤维素水解产物是木糖[4],所以木糖的乙醇发酵被视为植物纤维原料生物转化生产乙醇的关键[5]｡以实验室保藏的一株发酵木糖产乙醇能力较强的酵母菌为实验对象,对其发酵条件进行了优化,以期为该菌株在木质纤维素燃料乙醇生产工艺中的应用奠定基础｡

1材料与方法

1.1材料

实验用酵母菌为内蒙古科技大学生物工程与技术研究所筛选｡

1.2方法

1.2.1菌种发酵时间的确定将菌种种子液5 mL接入装液量为50 mL的木糖发酵培养基[50 g/L木糖+10 g/L(NH4)2SO4+2 g/L酵母粉+2 g/L KH2PO4 +1 g/L MgSO4] 的250 mL三角瓶中,35 ℃､70 r/min摇床培养,培养时间分别为24､48､72 h,反应结束后测定培养基中乙醇含量､木糖残余量和木糖转化率,确定其最佳发酵时间｡

1.2.2菌种发酵的厌氧好氧实验[6-8]将种子液10 mL接入装液量为100 mL的木糖发酵培养基的250 mL三角瓶中,在35 ℃分别静置和70 r/min摇床培养48 h,反应结束后测定培养基中乙醇含量､木糖残余量及木糖转化率,分析发酵特性｡

1.2.3目标菌种发酵条件响应面优化根据1.2.1与1.2.2的实验结果,采用design-expert软件,以温度､pH､接种量为自变量,发酵后培养基中乙醇含量为响应值(Y),设计3因素3水平响应面实验(表1)｡

1.2.4指标测定①乙醇含量:采用重铬酸钾氧化分光光度法测定[9];②木糖残余量:采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定[10];③木糖转化率=乙醇产量/[培养基中初始木糖量-木糖残余量]×100%｡

2结果与分析

2.1菌种发酵时间研究

培养基中乙醇含量随发酵时间的延长先逐步上升,在48 h时达到峰值,之后随时间的延长而下降(图1),可能是发酵产物被菌株消耗引起的;木糖含量随时间的延长呈下降趋势(图2),可见菌株在72 h内一直在对木糖进行利用;木糖转化率随发酵时间的延长下降(图3),可见菌株随着发酵的进行会消耗产物,导致木糖转化率下降,从转化效率来看发酵时间以24 h为宜｡

2.2菌种发酵的厌氧好氧实验

对目标菌株进行厌氧好氧实验,结果表明,静置发酵24 h后,培养基中乙醇含量为1.147 g/L,木糖转化率为66.3%,70 r/min摇床发酵24 h,培养基中乙醇含量为1.076 g/L,木糖转化率为48.6%｡可见与70 r/min摇床发酵相比,静置发酵乙醇产量和木糖的转化率都更高｡

2.3目标菌种发酵条件响应面优化结果

在50 mL种子培养基,静置发酵24 h的条件下进行响应面分析,实验结果见表2,方差分析见表3｡对实验数据进行回归拟合,可得发酵后培养基中乙醇含量对温度､pH和接种量的三元二次回归方程为:Y=0.93+0.16X1+0.11X2+0.23X3-0.018X1X2-0.26X1X3+0.053X2X3｡模型的P<0.01,表明模型是显著的;调整确定系数R2=0.959 6,表明该模型能很好地描述实验结果｡

响应面和等高线图见图4｡温度和接种量与培养基中乙醇含量存在显著的相关性,温度与接种量之间交互作用显著,温度低且接种量大则培养基中乙醇含量高;而pH对发酵后培养基中乙醇含量的影响不显著,与温度､接种量之间的交互作用不明显｡

利用软件分析得到乙醇含量最高的发酵条件为温度30.0 ℃､pH 6.0,接种量15.00%,理论获得乙醇含量为1.447 g/L｡

3结论

对实验室保藏的一株发酵木糖产乙醇能力较强的酵母菌的生长条件进行了初步研究｡结果表明,最适合菌株产乙醇的条件为30.0 ℃,接种量为15.00%,培养基的初始pH为6.0,静置发酵24 h｡

参考文献:

[1] 陈明.利用玉米秸秆制取燃料乙醇的关键技术研究[D].杭州:浙江大学,2007.

[2] 田沈,姚莹秋,蔺增曦,等. 木质纤维素稀酸水解糖液乙醇发酵研究进展[J]. 微生物学通报,2007,34(2):355-358.

[3] 陈辉,陆善祥. 生物质制燃料乙醇[J]. 石油化工,2007,36(2):107-117.

[4] 张亮,伍小兵,翟井振. 玉米秸秆发酵生产燃料乙醇的研究综述[J]. 安徽农业科学,2007,35(11):3365-3366.

[5] 刘巍峰,张晓梅,陈冠军,等. 木糖发酵酒精代谢工程的研究进展[J]. 过程工程学报,2006,6(1):138-143.

[6] 陈新芳,田沈,王菊,等. 提高木糖和葡萄糖乙醇产率的菌种驯化[J]. 太阳能学报, 2005,26(2):219-223.

[7] 靳艳,白凤武,何绣良,等. 融合SPSC发酵生产酒精的工艺研究Ⅰ.絮凝速率､发酵过程的最适温度和pH值[J]. 微生物学报,1996,36(2):115-120.

[8] HELLE S S, MURRAY A, LAM J,et al. Xylose fermentation by genetically modified saccharomyces cerevisiae 259ST in spent sulfite liquor[J]. Bioresource Technology,2004,92(2):163-171.

[9] 林仁权,胡文兰,陈国亮. 重铬酸钾氧化分光光度法测定酒中乙醇含量[J]. 浙江预防医学,2006,18(3):78-79.

[10] 董晓燕.生物化学实验[M]. 北京:化学工程出版社,2008.55.