第一部分：CopyControl Fosmid 建库试剂盒操作手册
注意事项：
1． （！！）操作人员必须避免将DNA 暴露在紫外灯光下，甚至是紧紧暴露一小段时间．．也会使克隆效率下降两个或两个以上的数量级。两种在DNA不暴露在紫外灯下从LMP 胶中切除DNA的方法见下页。
2． 试剂盒提供的36 kb Fosmid Control DNA可以用来当作琼脂糖凝胶电泳的Maker。 3． Ligated lambda control DNA (λcl 857 Sam7) 和control stain LE-392MP可以用来测试Maxplax Lambda Packageing Extracts 的效率。 准备工作：
1． 通过标准常规的方法从有机体中提取大分子片断的基因组DNA， 将其溶解在TE溶液中，浓度约为0.5 ug/ul，这些DNA将是克隆DNA的来源，在手册中将之称为“插入DNA”。
2． 菌种EPI300-T1R以甘油形式保存，在开始文库构建之前，挑取菌种在不含任何抗生素的LB平板上划线活化，37℃培养过夜，4℃密封保存。在噬菌体包装反应的前一天，挑取单菌落至含有10 mM MgSO4的50 ml LB 液体培养基中，37℃培养过夜。
步骤A：切割“插入DNA”
试剂盒所需材料：Fosmid Control DNA.
和通过部分限制性内切酶切割DNA所构建起来的具有较高偏向性的文库相比较而言，我们切割DNA至大小片断约为40kb ，所用的方法将具有更高的随机性。通常而言，基因组在先前的纯化过程中已经被充分切割过了，因而没有必要再进行进一步的切割，检测基因组 的切割程度，可以首先选择用少量的基因组DNA跑PFGE (如FIGE和CHEF等) 电泳，设定相应仪器跑开10-100kb DNA时的参数。在没有装置的情况下，可以将样品跑20厘米，1%浓度的琼脂糖凝胶电泳，30-35v过夜，将Fosmid Control DNA 加在邻近的胶孔中，同时用染料染色。
如果有大于等于10%的基因组DNA迁移的距离等同于Fosmid Control DNA，那么操作人员可以进入步骤 ；如果基因组DNA迁移的比Fosmid Control DNA慢（分子量偏大），那么DNA需要通过下面的步骤-1, 进行进一步的切割；如果基因组DNA迁移的比Fosmid Control DNA快（分子量偏小），那么该基因组DNA已经过渡的切割，基因组DNA需要重新分离纯化。
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1. 我们建议使用至少2.5 ug的基因组 。通过使基因组DNA经过200ul的小枪头进行切割。吹吸基因组DNA50-100次，通过琼脂糖凝胶电泳检测1-2ul 基因组DNA大小（Fosmid Control DNA作对照）。如果基因组DNA迁移的比Fosmid Control DNA慢（分子量偏大），那么DNA需要进一步的切割50次。
步骤 B：插入DNA的末端修复
试剂盒所需材料：End-repair enzyme Mix, 10 x Buffer, dNTPs, ATP.
该步骤能得到平末端、5-磷酸化的DNA。该末端修复的反应可以通过现有基因组DNA的量进行相应的扩大和缩小。
1． 分装前，融化并彻底混合下述试剂，冰上操作。
2 ul8 ul8 ul8 ul50 ul4 ul
无菌水10 x BufferdNTP Mix
ATP插入DNA
End-repair enzyme Mix
up to 80 ul
2． 室温下放置培养45分钟。
3． 加入电泳缓冲液，70℃条件下培养10分钟，使End-repair enzyme Mix酶失活。进入步骤C。
*步骤C： 末端修复DNA的大小选择
试剂盒中所需材料：Fosmid Control DNA
通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离选择所需大小的末端修复DNA。理想的条件是选用跑PFGE 电泳（如FIGE\\CHEF 等），wltage 和ramp times参数选择参考相应的分离10-100 kb DNA的参数设定。在没有仪器的条件下，可以将样品跑20厘米1%的琼脂糖凝胶电泳，30-35伏过夜。小胶（如10厘米）不能充分的分离大小在20-60 kb碱基之间的基因组DNA。
1． 准备一块1%LMP琼脂糖凝胶在1 x TAE 或1 x TBE中。注意：不要在凝胶中添加核酸染料或荧光染料。
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2． 在两侧胶孔中分别添加100 ng的Fosmid Control DNA，并在其间添加“末端修复的插入DNA”。
3． 通过30-35伏的稳定电压进行凝胶电泳（如室温下过夜）分离样品。观察和切除“末端修复的插入DNA”可以通过下述的两种方法之一来完成。
方法一：电泳结束后，切下外侧的含有Fosmid Control DNA的凝胶条带，将其用EB染色并在紫外光下观察DNA。用巴斯德管在凝胶条带的Fosmid Control DNA所在位置作标记。重新组装凝胶，并在36kb 同一位置及略微上方的位置（分子量大于36）切下2-4毫米的凝胶薄片。（警告：确信所切下的凝胶薄片回收的DNA片段大于25kb， 否则会引起奇怪克隆）。转移凝胶薄片至一涂有焦油的无菌15毫升带螺帽的塑料管中（注意：先称量螺帽管的干重）。 方法二：电泳结束后，根据仪器使用说明书将凝胶用SYBR Gold (分子探针) 染色。（略） 进入步骤D, 或将凝胶薄片保存在4℃或者-20℃条件下至多一年。
*步骤D：回收“已分离大小的DNA”
试剂盒中所需材料：GElase 50 x Buffer, GElase Enzyme preparation 在该步骤开始之前，准备70℃水浴和45℃水浴温度控制装置。
1． 计算凝胶重量。假设1毫克固态琼脂糖凝胶融化后能够产生1 微升液态的琼脂糖（见步骤2 ）
2． 加热50缓冲至45℃，将低熔点琼脂糖凝胶在70℃下培养15分钟，使其充分溶解。快速将管子转移到45℃水浴中。
3． 加入适当体积的加热的50倍缓冲至1倍的终浓度。在每100微升融化的琼脂糖中小心的加入1 单位（1微升）酶。将融化的琼脂糖溶液保持在45℃水浴中，并温和搅拌，培养至少1小时。
4． 将反应体系放置到70℃水浴中，使GElase Enzyme酶失活。 5． 移取500微升的整数倍的溶液至一灭菌的1.5毫升的小管中。
6． 将小管放入冰浴中冷却5分钟。将小管放入离心管中以最大速度离心20分钟。使任何聚集不溶的低级多糖凝集成小球。这些小球可能是黏胶的、半透明到不透明的。小心的移取上层90%-95%浮于表面的液体至一灭菌的1.5毫升的小管中，此中含有所需的DNA。注意避免黏胶小球的带入。 **7．沉淀DNA
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z z z z z z
加入1/10体积的3M 醋酸钠（pH7.0）。轻轻混合。 加入2.5倍体积的冰乙醇，盖上管盖，轻轻倒置混匀。 室温下沉淀10分钟。
以最大的速度离心沉淀DNA，20分钟。 小心的吸出上层溶液，弃。
用2倍体积的70%的冰乙醇洗涤DNA球状沉淀，重复离心，注意不要破坏
DNA球状沉淀。 z
在第二次洗涤DNA沉淀之后，小心的倒置小管，使DNA球状沉淀在管底空
中蒸干5-10分钟（时间不宜过长，否则DNA难溶解）。 z
温和的将DNA沉淀溶解于TE缓冲液中。
8． 用荧光法测定DNA浓度。或者通过将样品DNA和已知浓度的及其稀释液作为标准，跑凝胶电泳来估计浓度。注意不要通过分光光度计测量（DNA浓度低）。
步骤 E：连接反应
试剂盒中所需材料：Fast-Link 10 x ligation Buffer, Fast-Link DNA Ligase, ATP, Copycontrol PCC2Fos Cloning-ready Vector.
1． 首先参照附件A计算出所需构建的文库所需要的合适的 质粒的量。一个简单的反应将产生103-106的克隆，具体取决于“插入DNA”的质量。通过这些可以计算出需要连接反应的次数，连接反应可以扩大和缩小体系。
2． 混合下面列表中的溶剂，并在每添加完一种试剂后彻底混匀。Pcc2fos和“插入DNA”在摩尔比为10：1时最合适。 0.5微克的载体相当于 0.09 皮摩尔;
0.25微克40kb的“插入DNA”相当于0.09皮摩尔。
1 ul
无菌水
1 ul Fast-Link 10 x ligation Buffer1 ul
ATP
1 ul PCC2Fos Cloning-ready Vector
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5 ul 1 ul up to 10 ul
3． 室温下培养2小时。
插入DNA
Fast-Link DNA Ligase
4． 将反应体系转移到70℃，10分钟，使Fast-Link DNA Ligase酶失活。
步骤 F：Copycontrol Fosmid克隆的包装
试剂盒中所需的材料：Maxplax Lambda packaging Extracts, EPI300-T1R Plating Strain.
1． 在包装反应的前一天，将准备步骤中过夜培养的宿主菌EPI300-T1R Plating Strain接种到含有10毫摩尔/升硫酸镁的50毫升的LB培养集中，37℃摇床培养至OD600在 0.8-1.0之间，4℃保藏至步骤G，至多可以保藏72小时。
2． 冰上融化1管Maxplax Lambda packaging Extracts用于连接反应（见步骤E）。该连接反应可以扩大或缩小反应体系。
3． 在融化过程中，立即（！！！）转移25微升（一半）噬菌体提取物packaging Extracts到另一个1.5毫升的小管中，将剩余的25微升packaging Extracts放回-70℃冰箱供步骤F7使用。注意：不要将Maxplax Lambda packaging Extracts暴露于干冰或其他二氧化碳物质。
4． 加入10微升连接反应液至25微升已经冰上融化了的packaging Extracts中。 5． 用移液枪混匀液体数次，注意避免产生气泡（！！！！），简单的离心，使溶液都到小管底部
6． 30℃下包装90分钟。
7． 加入剩余的25微升packaging Extracts至管中（步骤F3） 8． 30℃下颚外包装90分钟。
9． 加入噬菌体稀释缓冲液（Phage Dilution Buffer配制）至1毫升。温和混匀。每管加入25微升氯仿。温和混匀后4℃ 保藏。在加入氯仿后可能会形成粘性沉淀，这些对文库构建不构成影响。在步骤G中对噬菌体微粒进行滴度测定（包装成功的质粒克隆）；在步骤H中将Fosmid文库涂平板；或者将噬菌体微粒用附件D的方法进行保存。
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步骤G：包装成功的Copycontrol Fosmid克隆的滴度测定
试剂盒中所需的材料：EPI300-T1R平板菌（步骤F1）
在将构建的文库涂平板之前，我们建议先进行噬菌体微粒的滴度测定。这将有助于我们根据所需要达到的要求来计算所需要的平板的数量以及稀释的程度。
1． 通过将步骤F9中得到的包装成功的噬菌体微粒加入到装有噬菌体稀释液的无菌小管中，得到一系列稀释度的溶液：
z 原液：将10微升包装成功的噬菌体原液直接备用；
z 1：102将10微升包装成功的噬菌体加入到990微升的PDB中稀释； z 1：104将10微升包装成功的噬菌体加入到990微升的PDB中稀释； 2． 分别加入10微升上述稀释液至步骤F1中准备好的100微升宿主菌溶液中，37℃培养20分钟。
3． 将感染了噬菌体的宿主菌EPI300-T!R涂布到含有12.5微克/毫升氯霉素的LB平板上去，37℃过夜培养，挑取Copycontrol Fosmid克隆。
4． 数克隆数，并计算步骤F9中成功包装噬菌体微粒的浓度。 假定按照1：104稀释的平板上长出200个克隆，那么， 克隆数 x 稀释倍数 x 100微升/毫升
涂布的体积
= 200个 x 104 x 100微升/毫升 = 2 x 108 cfu10微升
步骤 H：Copycontrol Fosmid文库的涂布和筛选
基于对包装成功的Copycontrol Fosmid克隆的滴度测定，以及对实验所需克隆数量的估计（见附件A），计算出构建Copycontrol Fosmid文库所需要的包装成功的Copycontrol Fosmid克隆的溶液体积。
1． 基于步骤G中对噬菌体微粒的滴度测定，将步骤F9中得到的噬菌体微粒用噬菌体稀释液PDB进行稀释，以得到所需要的克隆数及平板上的克隆密度。进入下一步或者按照附件D的说明保存稀释后的噬菌体微粒。
2． 按照每100微升EPI300-T1宿主菌溶液（步骤F1）中加入10 微升稀释后噬菌体微粒（步骤H1）的比例将两者混合。 3． 37℃噬菌体吸附20分钟。
R
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4． 将感染了噬菌体的细菌涂布到含有12.5微克/毫升的LB平板上，37℃过夜培养，挑选Copycontrol Fosmid克隆。
第二部分：<<诱导单拷贝克隆为高拷贝克隆>>方法
一旦我们获得了所需要的Copycontrol Fosmid克隆，就可将其诱导成高拷贝数的质粒，大量的DNA可以用于测序，fragorprinting 或其他用途。根据实验的需要和实验者本身，有两种不同的诱导方法可供选择。
“Copycontrol Induction Solution”(标准诱导)方案需要在诱导之前有一个过夜培养阶段。这将使实验者增加更多的操作时间。但这在使用和时间需求上来说更加自由。 “Copycontrol Fosmid Autoinduction Solution”(分装诱导)，不需要进行前培养，可以在接种前直接添加到培养基中去。这在使用96孔板或者其他高通量筛选这样前培养很乏味耗时的方法筛选Fosmid克隆时将是很有用的。
任意诱导方法均可在任何所需培养基体积中完成。一般而言，1毫升的培养液能够提供足够量的DNA供各种应用（1-2微克）。下面，我们提供了在1毫升、5毫升和50毫升培养体积下用的标准诱导方法进行放大的方案，而对于“antoinduction protocol”试验规模可以自由放大。
A.使用“Copycontrol Induction Solution”进行标准诱导：
克隆诱导接种的准备：
1． 在15毫升管中加入含有12.5微克/毫升氯霉素的LB培养基，供每一个需被诱导的克隆用。
2． 分别从过夜平板中接入一小杯所需的Copycontrol Fosmid克隆。 3． 37℃摇床培养过夜，将其作为放大反应接种的前培养。 拷贝数放大反应：
4． 参照下表，根据需要将合适体积的新鲜LB培养基（含氯霉素），过夜前培养物以及“copycontrol induction solution”混匀。使其有很好的通风性，将是非常重要的。因而，将其放在大一些的管子来增加表面积将是很有用的。例如，在1毫升体系时，使用1.5毫升甚至更大的管子。
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Clone induction
culture 1 ml 5 ml 50 ml
*融化后彻底混匀
LB+氯霉素（12.5
ug/ml） 800 ul 4.5 ml 45 ml
5 ml前培养物 200 ul 0.5 ml 5 ml
1000 x Copycontrol induction
solution 1 ul 5 ul 50 ul
5． 37℃剧烈摇动5小时，通风是关键！用能够得到最大通风量的方式来摇动管子。（例．．．．．如，水平摇动）
6． 离心并使用FosmidMax DNA Purification Kit纯化DNA。
TM
B.使用Copycontrol Fosmid Autoinduction Solution进行自动诱导
注意：如果将克隆接种至96孔板上，我们建议使用在2毫升大的孔板上加入1.2毫升的培养液。将96孔板小角度倾斜可以提高通风量并提高DNA产量。
1． 参照下表在适合体积的含有氯霉素的培养基中加入500 x Copycontrol Fosmid Autoinduction Solution.
500 x Copycontrol Fosmid
LB+氯霉素（12.5 ug/ml）
Autoinduction Solution
1 ml 5 ml 50 ml
*融化后彻底混匀
2 ul 10 ul 100 ul
2． 分别从过夜平板上接入一小环所需的Copycontrol Fosmid克隆。
3． 37℃ 摇床过夜培养（16-20小时），培养时间过长或者过短可能导致诱导反应的失败。通风非常重要！! ．．．．．．
4． 离心并使用FosmidMax DNA Purification Kit纯化DNA。
TM
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