快速色谱技术
W. Clark Still,* Michael K a h n , and Abhijit Mitra
Departm(7nt o/ Chemistry, Columbia Uniuersity,1Veu York, Neu; York 10027
ReceiLied January 26, 1978 我们希望找到一种简单的吸附色谱技术用于有机化合物的常规净化。这种技术是适于传统的有机物大规模制备分离，该技术需使用长柱色谱法。尽管这种技术得到的效果非常好，但是其需要消耗大量的时间，并且由于频带拖尾经常出现低复原率。当分离的样本剂量大于1或者2g时，这些问题显得更加突出。近年来，几种制备系统已经进行了改进，能将分离时间减少到1-3h，并允许各成分的分辨率ΔRf≥0.05（使用薄层色谱分析进行分析）。在这些方法中，在我们的实验室中，媒介压力色谱法1和短柱色谱法2是最成功的。最近，我们发现一种可以将分离速度大幅度提升的技术，可用于反应产物的常规提纯，我们将这种技术称为急骤色谱法。虽然这种技术的分辨率只是中等（ΔRf≥0.15），而且构建这个系统花费非常低，并且能在10-15min内分离重量在0.01-10.0g3的样本。4
急骤色谱法是以空气压力驱动的混合介质压力以及短柱色谱法为基础，专门针对快速分离，介质压力以及短柱色谱已经进行了优化。优化实验是在一组标准条件5下进行的，优化实验使用苯甲醇作为样本，放在一个20mm*5in.的硅胶柱60内，使用Tracor 970紫外检测器监测圆柱的输出。分辨率通过持续时间（r）和峰宽（w,w/2）的比率进行测定的（Figure 1），结果如图2-4所示，图2-4分别放映分辨率随着硅
胶颗粒大小、洗脱液流速和样本大小的变化。
从这些数据中间，我们可以得出许多有趣的事实。首先，我们发现最常使用的硅胶60的大小——70-230区间（63-200μm）在标准条件下产生的分辨率在所有被研究的数据中是最低的。第二，在我们使用的包装方法下，颗粒的大小小于40μm并不能提高分辨率。7柱效能对洗脱率的变化是相当敏感的，并且最好是用相
对较高的洗脱液流速。在乙酸乙酯/石油醚的混合物中（30-60℃），吸附床上的溶剂的头应该以2.0±0.1in./min的速度落下，这样才能得到最佳的分辨率。8最后，从峰值的宽度可以看出，随着样本的减少，分辨率呈现出预期的增加。样本的回收率≥95%。
这项技术所需要的设备包括一组色谱柱和阀门流量控制器（上图）。该色谱柱是一个拥有一个18in.的扁平底部，配有一个聚四氟乙烯活塞以及一个24/40玻璃接头的玻璃管。比起标准的多孔圆底，没有多孔玻璃床支持的色谱柱通常更受欢迎，因为它们显著地减少了死腔。流量控制器阀是一个能精确调节洗脱率的简单可变的液体排放装置，由一个玻璃/聚四氟乙烯针阀（Ace Glass Co. No. 8193-04 或相同性能的替代物）和一个标准的24/40接头组成。 详细的实验过程将在会在实验部分陈述。实验过程简单介绍如下：（1）溶剂应该能够提供良好的分离，并且能将所需成分提高到Rf=0.35（薄层色谱分析，E. Merck No. 5765）。9（2）需要合适参数（见Table Ⅰ）的色谱柱，色谱柱中装有5-6in.的40-63μm的干燥硅胶（E.Merck No.9385）。10（3）色谱柱内装满了溶剂，内部的压力能迅速将硅胶中所有的空气排空。（4）加入样本，再用溶剂将色谱柱注满，在2 in./min的流速下洗脱。
洗脱色谱柱所需成分的时间一般非常快（5-10min），因此我们已经抛弃了自动馏分收集器，取而代之的是放在架子上的40支20*150试管。小的部分通常只在洗脱早期早期进行收集，较大部分会从色谱分析的早期一直收集到最后。通过沿着7cm*2.5cm薄层色谱板的长边以~5μL为单位进行定点测量，之后再沿着侧板测量，可以方便的检测分离组件。小样本或
者高度保持的组件可能需要用到重定位。Figure6显示了一个典型的分离。
在过去的一年里，我们已经尝试了数以百计的色谱柱。在任何情况下，我们已经能够做到将完全分离ΔRf≥0.15的混合物在15min内完全分离，许多情况ΔRf≈0.10也是可以的。在给定的色谱柱中使用的样本数量与它的横截面积成正比，Table Ⅰ能作为色谱柱选择的指南。
如果分辨率要求不高，样本量可以大幅度增加；我们使用一个50-mm的色谱柱来对重量大于10g、ΔRf≥0.4的混合物进行纯化。甚至在直径大的色谱柱中，分辨率也能维持在一个能接受的标准。比如差向异构体的乙醇1和2的Rf分别为0.34和0.25，放入5%的乙酸乙酯/石油醚中。1.0g 1和2的混合物（ΔRf=0.09）在直径为40-mm的色谱柱中能在7min内与65-mg混合部分（500mL 5%的乙酸乙酯 /石油醚）轻松的被分开。
如果被分离的组件在薄层色谱法中ΔRf小于0.15，使用更长（例如，10in.）的硅胶色谱柱或者使用极性较小的溶剂能提高分辨率。可以使用在薄层色谱法中Rf=0.25溶剂去移动所需成分，这样不会大幅度提高洗脱时间。不论哪种情况，色谱柱应该只能轻轻地装满样品，并且应该将流速维持在2 in./min。很明显，在乙酸乙酯/石油醚混合物中，低流速会造成分辨率降低。
总之，急骤层析为只需要中等分辨率的混合物制备分离提供了一个快速且便宜的常规方
法。甚至在需要高分辨率时，使用快速技术作为初步净化能简化高分辨率的分离，从而避免了昂贵的高效液相色谱柱的污染。最后，我们想要强调这样一个事实，在这个方法中，使用40-63μm的硅胶和使用压力（而不是真空）驱使流率达2.0in./min对于成功分离是至关重要的。
实验部分
将色谱柱和流量控制器阀进行组装，组装方式如前所述。硅胶材料选用40-63μm（400-230 mesh）硅胶60（E. Merck No. 9385）。10
溶剂在使用之前需要被蒸馏。薄层色谱会在玻璃支持的硅胶60板上进行（0.25-mm厚，F-254）（E.Merck No. 5765）。 急骤层析技术的一般过程。首先应该找到一个低粘度溶剂系统（例如，乙酸乙酯/30-60℃石油醚）8，这个系统能分离混合物并且能移动所需成分，使得所需成分在薄层色谱分析上的Rf为0.35。如果几种在薄层色谱分析上非常相近的化合物需要分开，调整溶剂，在Rf=0.35时使得中间点在所有混合物之间。如果这些化合物是广泛分散的，将活动较小成分的Rf调整到0.35。在选好合适的溶剂之后，需要挑选合适直径的色谱柱（在文中，Table Ⅰ ），并将一个玻璃棉制成的小塞子放置在试管中，用于连接活塞和色谱柱的体部（上面图中的A）。两个可伸缩的玻璃管（6和8 mm 0.d.）使得玻璃棉塞子的位置易于调整。接下来，一个由50-100 mesh沙组成的 1/8 in.的光滑层覆盖在色谱柱的底部，将40-63μm的干硅胶倒入色谱柱单独的部分内，深度为5.5-6in.随着活塞打开，将色谱柱轻轻地垂直于桌面拔出，直至包裹凝胶。之后将一个1/8 in.的沙层干凝胶床的平面顶部，夹紧色谱柱以便加压填充和包裹。将之前选择的溶剂在从沙的上面小心的倒入并完全填充色谱柱。流量控制器的调流调压阀（B）一直是打开的，流量控制器是紧密安装在色谱柱的顶部，并由强大的橡皮筋加固。控制流量控制器的主要空气线阀是轻微打开的，一个手指必须严格地放置在泄放孔（C）。硅胶的顶部必须持续保持湿润。接下来用移液管将样品（在洗脱
液中为20-25%的溶液）从吸附床的顶部加入，流控制器暂时地放在色谱柱的顶部，以便驱动所有的样品进入硅胶。11通常用包裹色谱柱的溶剂来洗涤色谱柱。色谱柱壁用几毫升新鲜洗涤液进行冲洗，冲洗之后的液体像之前一样被推入凝胶中，色谱柱内完全被填满了洗涤液以便不能扰乱吸附床。流量控制器最终被固定在色谱柱上，调整色谱柱中溶剂的表面以2.0 in./min的速度下滑。颗粒直径在40-63μm时，对于大多数低粘度的溶剂这似乎是流速的最佳值。所有的溶剂用完之前，部分一直在被收集（溶剂的量和分数的大小参考Table Ⅰ）。最好保持色谱柱湿润，因为进一步的洗涤偶尔是有必要的。纯化组件和之前描述一样。如果严格遵守之前的介绍的操作流程，几乎不可能分离失败。
虽然我们一般为每次分离包装新鲜色谱柱，但是大规模分离的花费使得它有利于重用大直径色谱柱。色谱柱的重复使用受第一次冲洗的影响（速率=2in./min），第一次冲洗首先用大约5in.的洗涤液（通常是乙酸乙酯或丙酮）中极性更大的成分冲洗，然后用5in.所需洗涤液冲洗。如果洗提液相对非极性的（比如小于10%乙酸乙酯/石油醚），使用冲洗溶剂（比如小于20-50%乙酸乙酯/石油醚）可能更明智，冲洗溶剂比起纯高极性成分极性稍微小一些。
参照和注释
(1) Such units have been described and used extensively by J. M. McCali.
R .E. TenBrinkt, and C. H. Lin at the Upjohn Company and A. I. Meyers
atColorado State University
(2) B. J. Hunt and W.Rigby, Chern. Ind. (London), 1868 (1967).
(3) This is not a limitation but is merely the scale range which we have used. (4) This is the total time requiredfor column packing, sample application, and complete elution.Standard conditions:
（5） in. high bed of 40-63 pm silica gel 60 in a 20 mm
diameter column packed as described in text, 2.0 in. of solvent flow/min,200 mg of benzyl alcohol. 25% ethyl acetate/petroleum ether eluant.
（6）These gels are manufactured by E. Merck and are the following grades:<40 p m (silica gel H,No. 7736), 25-40 pm (LiChroPrep Si60,
No.9390),40-63 pm (silica gel 60, No. 9385), 63-200 pm (silica gel 60,
No.10180\\.
(7) Slurry packing, incrementaldry packing, or single portion dry packinggave identical results with the 40-63 pm gel. Since the last technique was the simplest, it was employed in ail our studies.
(8) This is a particularly good general solvent system. For extremely polar
compounds, acetone/petroleum ether or acetone/methylene chloride mixtures are often useful. Significantly higher viscosity solvents will require slower optimum resolution flow rates.
(9) If this R, is given by a solvent having <2% of the polar component,a slightly less polar eluant is desirable. Thus if 1% ethyl acetate/petroleum ether gives a compound an R, of 0.35 on TLC, the column is run with
0.5% ethyl acetate.
(10) 40-63 pm gel is also used for medium pressure chromatography' and is available from MCB in 1 kg ($45/kg) or 25 kg ($16/kg) lots.
(11) if the sample is only partially soluble in the eluant, just enough of the more polar component is added to give complete dissolution. Large quantities of very polar impurities are best removed prior to chromatography
so that excessive quantities of solvent or large increases in solvent polarity
willbe unnecessary for sample application.
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容